發(fā)布時(shí)間：2020-11-16 12:58

　　 黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類之一。近年來,隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)也因受到細(xì)菌性疾病的危害而造成了較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。白細(xì)胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)是一種關(guān)鍵的早期促炎癥細(xì)胞因子,在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)以及細(xì)菌感染時(shí)誘導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)方面具有重要作用。白細(xì)胞介素I型受體(IL-1RI)可以結(jié)合IL-1β并能調(diào)節(jié)依賴IL-1的激活作用。因此,對黃顙魚白細(xì)胞介素1β(Pf_IL-1β)和其受體I(Pf_IL-1RI)基因的分子特征以及在免疫反應(yīng)中的作用進(jìn)行研究,對黃顙魚的病害防控具有重要的意義。本研究克隆了黃顙魚Pf_IL-1β和Pf_IL-1RI基因部分cDNA序列并對其分子特征進(jìn)行了分析。采用熒光定量PCR技術(shù)對黃顙魚Pf_IL-1β和Pf_IL-1RI基因在成魚不同組織、早期發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行了分析,對鮰愛德華氏菌刺激后2個(gè)基因在黃顙魚6種組織中的表達(dá)變化進(jìn)行了檢測。采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測了黃顙魚Pf_IL-1β蛋白在成魚的組織分布及鮰愛德華氏菌刺激后在頭腎中表達(dá)的變化。主要結(jié)果如下:1.黃顙魚Pf_IL-1β和Pf_IL-1RI基因cDNA序列的克隆和序列分析黃顙魚Pf_IL-1βcDNA部分序列長度1102 bp,包含一個(gè)編碼280個(gè)氨基酸序列的843 bp的開放閱讀框和259 bp的3'非翻譯區(qū)(UTR),3'端有3個(gè)mRNA不穩(wěn)定基序(ATTTA)和1個(gè)多腺苷酸信號序列(AATAAA)。BLAST序列比較顯示Pf_IL-1β氨基酸序列與斑點(diǎn)叉尾鮰IL-1β的相似性最高(86.4%),其次為斑馬魚(52.3%)和鯉(44.3%)。黃顙魚Pf_IL-1RI基因cDNA序列開放閱讀框長度1632 bp,編碼543個(gè)氨基酸。Pf_IL-1RI氨基酸序列與墨西哥脂鯉(53.8%)、大西洋鮭(45.3%)和斑馬魚(45.0%)的IL-1RI相似性較高。2.黃顙魚Pf_IL-1β和Pf_IL-1RI基因mRNA在成魚各組織及早期發(fā)育時(shí)期的表達(dá)黃顙魚Pf_IL-1β和Pf_IL-1RI基因mRNA在成魚13種組織中均有表達(dá)。Pf_IL-1βmRNA在體腎、血液、心臟、肌肉、頭腎和脾臟中的表達(dá)量較高,Pf_IL-1RI mRNA在血液中表達(dá)量最高,其次是肝臟、脾臟、體腎和頭腎。在黃顙魚早期發(fā)育階段,Pf_IL-1βmRNA在未受精卵中的表達(dá)量極高,表達(dá)量在受精卵中顯著降低到中等水平,在多細(xì)胞期進(jìn)一步降低到較低水平。從囊胚晚期到心跳期,除了肌肉效應(yīng)期表達(dá)量較低之外,Pf_IL-1βmRNA表達(dá)量處于中等水平。Pf_IL-1βmRNA表達(dá)量在出膜前期顯著下降到較低水平,并持續(xù)至出膜后第10 d。在黃顙魚未受精卵中未檢測到Pf_IL-1RI mRNA的表達(dá),在受精卵中Pf_IL-1RI mRNA表達(dá)量顯著上升至中等水平,在體節(jié)出現(xiàn)期其表達(dá)量達(dá)到峰值。隨后,Pf_IL-1RI mRNA表達(dá)量在肌肉效應(yīng)期顯著下降,并逐漸在出膜前期下降至較低水平。從孵出至出膜后第5 d,Pf_IL-1RI mRNA表達(dá)量處于較低水平,但在出膜后第7~10 d,其表達(dá)量顯著上升至中等水平。3.鮰愛德華氏菌刺激后黃顙魚Pf_IL-1β和Pf_IL-1RI基因mRNA在6種組織中表達(dá)量的變化鮰愛德華氏菌感染后黃顙魚Pf_IL-1β和Pf_IL-1RI基因mRNA在體腎、頭腎、血液、脾臟、心臟和肝臟中的表達(dá)量均顯著上調(diào)。在體腎和頭腎中,Pf_IL-1βmRNA在鮰愛德華氏菌刺激后從6~120 h均為極顯著上調(diào)。在體腎中,Pf_IL-1βmRNA表達(dá)量逐漸升高并在72 h達(dá)到峰值,然后在120 h降到中等水平,而在頭腎中,其表達(dá)量在6 h快速達(dá)到峰值,然后在48~120 h逐漸降至中等水平。在血液中,Pf_IL-1βmRNA表達(dá)量除了在12 h上調(diào)外,6~48 h都顯著下調(diào),然后在72 h顯著上調(diào)并達(dá)到峰值。在心臟中,其表達(dá)量在6 h顯著上調(diào),在24 h進(jìn)一步升高并達(dá)到峰值,然后在48 h降低至較低水平,48~120 h有所波動(dòng)。在脾臟中,Pf_IL-1βmRNA表達(dá)量在6 h時(shí)顯著上調(diào),24 h達(dá)到較高水平,48 h有所下降后再一次升高并在120 h達(dá)到最大值。在肝臟中,其表達(dá)量在6 h顯著上調(diào),然后進(jìn)一步升高并在72 h達(dá)到峰值。在體腎中,黃顙魚Pf_IL-1RI mRNA表達(dá)量從6~24 h均極顯著下調(diào),在48 h顯著上調(diào)并在72 h達(dá)到峰值,后在120 h極顯著下調(diào)。在頭腎中,Pf_IL-1RI mRNA表達(dá)量在6 h顯著上調(diào)并逐漸升高到72 h達(dá)到最大值,然后在120 h顯著下調(diào)。在血液和心臟中,鮰愛德華氏菌刺激后Pf_IL-1RI mRNA表達(dá)量在6~120 h均顯著上調(diào),血液中的表達(dá)量在12 h達(dá)到峰值而心臟中的表達(dá)量在48 h達(dá)到峰值。在脾臟中,其表達(dá)量在6 h輕微上調(diào),12~120 h顯著上調(diào)且在24 h達(dá)到峰值。在肝臟中,Pf_IL-1RI mRNA表達(dá)量在6 h達(dá)到峰值,除了在72 h顯著下調(diào)外,在12~120 h均顯著上調(diào)。4.黃顙魚Pf_IL-1β蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和免疫印跡分析重組原核表達(dá)載體pGEX-4T-1β被成功構(gòu)建。重組蛋白在28°C,IPTG濃度為1.0 mM,培養(yǎng)5 h的最佳誘導(dǎo)條件下在包涵體中大量表達(dá)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示黃顙魚Pf_IL-1β蛋白在成魚各組織中的脾臟和頭腎里表達(dá)量較高,但在鰭條中未被檢測到。鮰愛德華氏菌刺激后24~120 h,Pf_IL-1β蛋白在黃顙魚頭腎中顯著上調(diào)。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

88（MyD 88）、IL-1受體相關(guān)激酶（IRAK）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子6（TRAF6），來激活NF-κB通路和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)（p38，JNK，ERK），啟動(dòng)細(xì)胞核中一系列基因的表達(dá)（Lu et al 2008）（圖1-1）。

以及早期發(fā)育階段，采用 S差分析（One-WayANOVA）免疫刺激試驗(yàn)中，對照組和檢驗(yàn)。分析基因的相對表達(dá)1，則認(rèn)為有極顯著差異。NA 質(zhì)量進(jìn)行了檢測，其吸 純度的要求。經(jīng)過瓊脂糖電帶，它們分別為 28S、18S 和 錄實(shí)驗(yàn)。

3'UTR含有 3 個(gè) mRNA 不穩(wěn)定基序（ATTTA）和 1 個(gè)多腺苷酸信號序列（AATAAA）（圖2-2/2-3）。預(yù)測其蛋白分子量約為 31.85 kDa，等電點(diǎn)為 4.99。圖 2-2 黃顙魚 Pf_IL-1β 基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 2-2 PCR amplification product of partial Pf_IL-1β cDNA of P. fulvidracoM：2000 bp DNA Marker；1：中間片段擴(kuò)增產(chǎn)物；2：3' RACE 產(chǎn)物。M: 2000 bp DNA Marker; 1: product of Pf_IL-1β; 2: product of 3' RACE.
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2886257