發(fā)布時間：2020-10-30 23:07

　　 ε-聚賴氨酸(ε-PL)是由微生物代謝產(chǎn)生的一種水溶性、可生物降解且具廣譜抗微生物活性的多肽類物質(zhì),其主要用于食品防腐劑上,但對植物病毒和植物病原真菌的抑制作用和機(jī)制尚未見報道,本文利用從細(xì)黃鏈霉菌遼寧致病變種中分離純化獲得的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的ε-PL(發(fā)明專利受理號:201910330737.2)進(jìn)行溫室盆栽、熒光檢測、Northern blot分析和透射電子顯微鏡觀察等試驗(yàn),研究了ε-PL對煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的抑制作用及機(jī)制;又通過平板抑菌試驗(yàn)、離體葉接種試驗(yàn)、孢子萌發(fā)抑制試驗(yàn)和實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)試驗(yàn),研究了ε-PL對植物真菌病害的防治作用及機(jī)理;通過對ε-PL處理后煙草BY-2細(xì)胞的RNA-Seq測序分析,研究了ε-PL對煙草植株抗病相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)作用。以上研究為深入了解ε-PL對植物病毒和植物病原真菌的抑制作用及其機(jī)制提供了重要理論基礎(chǔ)。主要研究成果如下:1.ε-PL對TMV有明顯鈍化作用和預(yù)防效果。ε-PL在2000μg/ml濃度處理枯斑寄主心葉煙時,對TMV的鈍化抑制率和預(yù)防效果分別達(dá)到90.6%和79.3%,同濃度ε-PL處理系統(tǒng)侵染寄主普通煙NC89,對TMV的鈍化和預(yù)防效果分別為72.35%和56.7%;熒光檢測接種了轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白(GFP)TMV的本氏煙苗,結(jié)果顯示無論是接種葉、上位葉還是頂葉的熒光斑點(diǎn),藥劑處理組都較對照組明顯減少,其中100μg/mlε-PL處理的本氏煙的頂葉基本未見熒光斑點(diǎn),而對照組頂葉綠色熒光區(qū)域明顯;Northern blot檢測分析了不同濃度ε-PL處理下接種TMV的煙葉和煙草BY-2原生質(zhì)體,結(jié)果顯示ε-PL處理下樣品中TMV-RNA的量明顯減少,表明ε-PL影響了病毒核酸的合成和積累量;透射電子顯微鏡觀察結(jié)果表明,ε-PL可使病毒粒子發(fā)生斷裂、破損等現(xiàn)象。2.ε-PL對植物病原真菌具有顯著抑菌作用。用不同濃度的ε-PL對煙草赤星病菌、黃瓜褐斑病菌和水稻惡苗病菌進(jìn)行平板抑菌試驗(yàn),結(jié)果顯示ε-PL對煙草赤星病菌和黃瓜褐斑病菌可以產(chǎn)生清晰明顯的抑菌圈,且ε-PL對煙草赤星病菌的最小抑菌濃度(MIC值)為5μg/ml,對黃瓜褐斑病菌的MIC值為10μg/ml,但ε-PL對水稻惡苗病菌的抑菌效果不顯著;離體葉接種試驗(yàn)表明,ε-PL對煙草、黃瓜離體葉有明顯阻止病斑擴(kuò)展的作用,且與對照相比,ε-PL對煙草赤星病斑擴(kuò)展的阻止效果更為顯著;ε-PL對病菌菌絲生長的抑制試驗(yàn)表明,200μg/mlε-PL處理3天時對煙草赤星病菌菌絲生長的抑制率達(dá)92%,處理7天的抑制率也高達(dá)87%左右,表明ε-PL穩(wěn)定性好,抑制作用強(qiáng),可以長時間控制菌絲生長;ε-PL對病菌孢子萌發(fā)和芽管形態(tài)影響顯微觀測表明,當(dāng)25μg/ml的ε-PL處理24h后,煙草赤星病菌孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管會出現(xiàn)皺縮、畸形等變化;當(dāng)濃度達(dá)到200μg/ml時,對孢子萌發(fā)的抑制率接近98%;ε-PL對煙草赤星病菌菌絲萌發(fā)及生長相關(guān)基因如環(huán)腺苷酸依賴性蛋白激酶A基因(PKA)、Alternaria alternata環(huán)腺苷酸依賴性蛋白激酶催化亞基(AAPK1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)和5.8s核糖體rRNA代表基因進(jìn)行qPCR檢測,結(jié)果顯示前三個基因在ε-PL處理后發(fā)生顯著下調(diào)表達(dá),從分子水平揭示了ε-PL對真菌抑制的作用機(jī)制。3.為了進(jìn)一步了解ε-PL對寄主是否具有誘抗作用,利用ε-PL處理煙草BY-2細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序及功能分析。差異基因聚類分析結(jié)果表明,煙草熱休克同源蛋白70 kDa基因和與衰老相關(guān)蛋白等1350個基因表達(dá)量與對照相比顯著上調(diào),而煙草花色素3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因和煙草葉片表皮特異性分泌型糖蛋白等1700多基因與對照相比表達(dá)量發(fā)生顯著下調(diào)表達(dá);差異基因Gene Ontology(GO)富集性分析顯示,ε-PL處理后煙草細(xì)胞顯著差異表達(dá)基因在生物學(xué)功能中主要富集于轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因上,在細(xì)胞組分中主要富集于與細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜和膜的組成相關(guān)的基因上,在分子功能方面主要富集于與蛋白質(zhì)結(jié)合相關(guān)、與轉(zhuǎn)錄相關(guān)或與有特殊序列的DNA結(jié)合功能相關(guān)的基因上,以上基因間接起到調(diào)控植物生長發(fā)育、進(jìn)化和抗逆境等作用。差異基因Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集性分析顯示,差異基因主要富集于與植物熱反應(yīng)相關(guān),與毒素代謝相關(guān),與氧化反應(yīng)相關(guān)等重要通路上。綜上推測,ε-PL對煙草具有誘導(dǎo)抗病性作用。
【學(xué)位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S432.41;S432.44
【部分圖文】：

圖 2-1 不同濃度 ε-PL 對普通煙上 TMV 的抑制效果 2-1 Inhibition effect of different concentrations of ε-PL on TMV on N. tabacum L. cv.

圖 2-2 500 μg/ml ε-PL 處理心葉煙上 TMV 的枯斑抑制效果Figure 2-2 Anti-TMV effect on N. glutinosa treated with 500 μg/ml ε-PL

圖 2-3 不同濃度 ε-PL 處理下接種 TMV 心葉煙的枯斑狀況Figure 2-3 Nocrotic lesions on N. glutinosa inoculated with TMV under differentconcentrations of ε-PL
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本文編號：2863124