發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 16:50

　　 研究背景:病原菌的快速準(zhǔn)確鑒定和耐藥性分析對(duì)于人體健康,安全檢查和食品安全控制至關(guān)重要。提高抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)的時(shí)效性是避免抗生素濫用和減少抗生素耐藥的關(guān)鍵。臨床常規(guī)病原菌鑒定和藥敏試驗(yàn)依賴于細(xì)菌培養(yǎng)的鑒定方法,該方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確,但操作繁瑣,檢測周期超過24小時(shí),尚不能滿足臨床病原菌快速偵檢的實(shí)際需求。以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的鑒定方法如實(shí)時(shí)熒光PCR已廣泛用于檢測和鑒定細(xì)菌,提高了檢測效率,但仍存假陽性和無法區(qū)分病原菌生存狀態(tài)等不足。新型質(zhì)譜診斷技術(shù)簡便快速,質(zhì)譜技術(shù)已從實(shí)驗(yàn)室研究廣泛走向臨床微生物的種屬鑒定分析,但其檢測尚依賴于細(xì)菌培養(yǎng),檢測靈敏度有待提高。因此,建立一種簡便快速、無標(biāo)記的細(xì)菌鑒定方法,對(duì)于臨床常見致病菌的有效甄別和耐藥性分析、公共安全細(xì)菌監(jiān)測和食品安全檢查均具有重大現(xiàn)實(shí)意義。拉曼光譜是一種散射光譜,拉曼散射(Raman scattering)是由光照射到物質(zhì)上產(chǎn)生的非彈性散射,這種非彈性散射改變了入射光子的頻率,拉曼散射光和瑞利光的頻率之差稱之為拉曼位移。拉曼位移取決于生物分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)頻率,與生物分子的化學(xué)鍵、官能團(tuán)等相關(guān)。因此,拉曼光譜為每一種物質(zhì)所特有的特征指紋譜,拉曼光譜的峰位置、強(qiáng)度、線寬等特征與物質(zhì)分子的振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)相關(guān),提供了生物分子的結(jié)構(gòu)和含量等信息。拉曼光譜在生物分子的定性、定量檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景,然而,由于分子的拉曼散射截面小、拉曼散射信號(hào)微弱,難以直接檢測。表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman scattering,SERS)是指入射光在粗糙的類自由電子的金屬如金、銀、銅等基底表面,激發(fā)金屬產(chǎn)生表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR),在基底表面產(chǎn)生局域等離子體電場增強(qiáng),進(jìn)而產(chǎn)生SERS。基于SPR的SERS增強(qiáng)因子可達(dá)10~6-10~(12),因此,SERS具有更高的探測靈敏度、分辨率和信噪比�；�于SERS的檢測方法在微生物檢測相關(guān)的食品安全、環(huán)境檢測和臨床診斷等領(lǐng)域已有相關(guān)報(bào)道�；�于SERS的病原菌檢測包括標(biāo)記檢測和無標(biāo)記檢測兩大類。SERS無標(biāo)記檢測無需拉曼分子標(biāo)簽,提供了病原菌的特征拉曼光譜信息,有望用于病原菌的快速定性檢測。SERS增強(qiáng)材料包括金屬基底和金屬溶膠,其中金屬溶膠由于制備簡便、成本低、易于保存而廣泛應(yīng)用。銀納米顆粒(silver nanoparticles,AgNPs)對(duì)于病原菌的SERS增強(qiáng)性能優(yōu)越,應(yīng)用最為廣泛。然而,臨床病原菌的鑒定缺乏標(biāo)準(zhǔn)的病原菌拉曼光譜數(shù)據(jù)庫,病原菌的拉曼位移峰的歸屬尚不明確,無標(biāo)記SERS技術(shù)對(duì)于致病菌的耐藥性分析更是鮮有報(bào)道。綜上所述,本研究針對(duì)臨床對(duì)于病原菌快速檢測和耐藥性分析的迫切需求,結(jié)合SERS技術(shù)、多變量統(tǒng)計(jì)分析和機(jī)器學(xué)習(xí)方法等,探索不同納米材料檢測病原菌的表面增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)(SERS效應(yīng)),建立基于AgNPs的SERS檢測方法,結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析,用于臨床常見病原菌種屬鑒定和耐藥性分析。進(jìn)一步采用機(jī)器學(xué)習(xí)方法,建立判別分析模型,對(duì)耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)進(jìn)行判別分析,尋找MRSA與甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA)的差異特征,在金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)的耐藥菌株差異特征分析做了初步探討,有望為病原菌的快速檢測提供新方法。研究目的:本研究擬構(gòu)建簡便、無標(biāo)記的基于AgNPs~+的SERS檢測方法,結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析和機(jī)器學(xué)習(xí)方法,用于S.aureus的種屬鑒定、臨床MRSA菌株的判別分析以及篩選MRSA的差異分子,為臨床感染性疾病快速診斷、避免抗生素濫用、減少抗生素耐藥提供新的思路和新的方法。材料與方法:1.不同種類納米材料用于病原菌檢測的SERS效應(yīng)研究(1)合成納米材料,包括金銀納米核殼復(fù)合(gold-silver nano-core shell composite material,AuNR@Ag)材料、金納米三角片-金納米顆粒復(fù)合物(gold nano-triangle-gold nanoparticle composite,TAuNPs-AuNPs)及AgNPs膠體溶液。(2)不同納米材料及其與S.aureus結(jié)合前后的表征,包括紫外-可見光(ultraviolet-visible absorption spectrum,UV-Vis)、掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM)、透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM)、Zeta電位、粒徑分析、能譜分析的表征(energy dispersive spectrometer analysis,EDS)。(3)驗(yàn)證不同納米材料檢測病原菌的SERS效應(yīng)。2.基于AgNPs~+的SERS檢測病原菌的方法學(xué)評(píng)價(jià)(1)基于AgNPs~+的SERS檢測S.aureus的條件優(yōu)化。(2)基于AgNPs~+檢測S.aureus的SERS效應(yīng)驗(yàn)證。(3)基于AgNPs~+的SERS檢測S.aureus的方法學(xué)評(píng)價(jià),包括靈敏度、特異性、重復(fù)性等方法學(xué)指標(biāo)的評(píng)價(jià)。3.基于AgNPs~+的SERS檢測技術(shù)用于病原菌的種屬區(qū)分和耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的檢測(1)菌株的收集和菌液的制備,包括床菌株的收集、鑒定和藥敏試驗(yàn)以及標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇。(2)不同種屬病原菌以及臨床MRSA菌株的拉曼光譜檢測。(3)基于多變量統(tǒng)計(jì)分析不同種屬病原菌以及MRSA的拉曼光譜數(shù)據(jù)。(4)基于機(jī)器學(xué)習(xí)方法,建立和評(píng)價(jià)MRSA的判別分析模型。研究結(jié)果:1.不同種類納米材料用于病原菌檢測的SERS效應(yīng)研究(1)成功的制備了AuNR@Ag核殼材料、AuNR@Ag SERS基底,以及帶正電的銀納米顆粒(positively charged silver nanoparticles,AgNPs~+)和帶負(fù)電的銀納米顆粒(negatively charged silver nanoparticles,AgNPs~-)。(2)AuNR@Ag基底檢測可獲得了細(xì)菌的特征譜,但AuNR@Ag基底的空白信號(hào)對(duì)細(xì)菌的特征譜有覆蓋。Q-SERS對(duì)拉曼報(bào)告基團(tuán)的增強(qiáng)效應(yīng)顯著,報(bào)告基團(tuán)的特征峰明顯。但Q-SERS基底對(duì)于細(xì)菌檢測的增強(qiáng)效應(yīng)不顯著。(3)AgNPs~+通過靜電結(jié)合,緊密包裹到細(xì)菌表面。AgNPs對(duì)于細(xì)菌檢測的增強(qiáng)效應(yīng)顯著。AgNPs~+增強(qiáng)效應(yīng)比AgNPs~-顯著。2.基于AgNPs~+的SERS檢測病原菌的方法學(xué)評(píng)價(jià)(1)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化為AgNPs~+與S.aureus的孵育時(shí)間為30 min,AgNPs~+與S.aureus的體積比為1:1,S.aureus的菌液配置緩沖液為超純水,AgNPs~+的粒徑選取65 nm。(2)成功建立了基于AgNPs~+的SERS檢測方法。驗(yàn)證了AgNPs~+檢測S.aureus的SERS效應(yīng)。AgNPs~+增強(qiáng)因子達(dá)10~7,AgNPs~+在730 cm~(-1)的峰強(qiáng)度比AgNPs~-的強(qiáng)3.4倍。(3)基于AgNPs~+的SERS檢測方法可探測單個(gè)S.aureus的拉曼光譜信號(hào)。采用分離培養(yǎng)和拉曼光譜的多變量統(tǒng)計(jì)可區(qū)分S.aureus與其他屬病原菌。該檢測方法的重復(fù)性在可接受范圍內(nèi),批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為12.7%,批間RSD為14.31%。該方法成功用于臨床樣本中的S.aureus檢測。3.基于AgNPs~+的SERS檢測技術(shù)用于病原菌的種屬區(qū)分和MRSA的檢測(1)細(xì)菌與真菌的拉曼光譜峰位置、峰強(qiáng)度差異顯著。革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的拉曼光譜的拉曼峰位置、峰強(qiáng)度具有明顯差別。組成分分析(principal component analysis,PCA)或偏最小二乘法判別分析(latent structure discriminant analysis classification,PLS-DA)可區(qū)分不同屬病原菌。正交偏最小二乘法判別分析(latent structure discriminant analysis classification,OPLS-DA)S.aureus與其他屬的差異變量主要位于721-735 cm~(-1)、1316-1322 cm~(-1)、647-656 cm~(-1)、1618-1626 cm~(-1)等拉曼位移處。(2)同屬不同種或不同株之間的拉曼光譜肉眼無法直接區(qū)分。PCA或?qū)哟尉垲惙治?Hierarchical clustering analysis,HCA)可區(qū)分同屬不同種、不同株病原菌的拉曼光譜。PLS-DA分析S.aureus 29213與S.aureus 25923的差異特征主要分布在729-735cm~(-1)和1319-1335 cm~(-1)。(3)MRSA與MSSA的拉曼光譜譜峰的位置、強(qiáng)度和相對(duì)強(qiáng)度比例可見差異。MRSA在727-730 cm~(-1)、1322-1325 cm~(-1)拉曼位移處的峰強(qiáng)度相對(duì)低,而在1003-1006cm~(-1)、1154-1159 cm~(-1)、1237 cm~(-1)和1518-1521 cm~(-1)的峰強(qiáng)度相對(duì)高。(4)PCA不能直接區(qū)分MRSA與MSSA。HCA、PLS-DA可區(qū)分兩者。MRSA的不同組R1、R2、R3、R4相互之間也可區(qū)分。OPLS-DA分析MRSA與MSSA拉曼光譜的差異變量主要位于513-519 cm~(-1)、727-732 cm~(-1)、1147-1152 cm~(-1)、1513-1521 cm~(-1)。多變量統(tǒng)計(jì)分析模型的R~2X(cum)為0.87,R~2Y(cum)為0.712,Q~2(cum)為0.73。(5)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類器對(duì)于MRSA和MSSA的判別分析受試者曲線下面積(area under the curve,AUC)值為0.986,精確率為0.960,召回率為0.959,初步選取神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)為S.aureus臨床耐藥菌株的分類模型。機(jī)器學(xué)習(xí)方法篩選的MRSA和MSSA差異特征主要為721-727 cm~(-1)、697.821 cm~(-1)、960-972 cm~(-1)、1314.27 cm~(-1)、750-756 cm~(-1)、510.72 cm~(-1),可與OPLS-DA分析的結(jié)果互補(bǔ)。研究結(jié)論:1.本研究系統(tǒng)性的評(píng)估了不同種類納米材料用于病原菌無標(biāo)記檢測的SERS效應(yīng),篩選AgNPs~+作為檢測病原菌的增強(qiáng)材料,其增強(qiáng)因子達(dá)10~7。建立并評(píng)價(jià)了基于AgNPs~+的SERS檢測方法,該研究方法可探測到單個(gè)細(xì)菌的拉曼信號(hào)。該檢測方法的批內(nèi)RSD為12.7%,批間RSD為14.31%。通過多變量統(tǒng)計(jì)分析病原菌的拉曼光譜,初步區(qū)分不同屬、不同種、不同株的病原菌。進(jìn)一步對(duì)臨床菌株MRSA與MSSA的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行區(qū)分,多變量統(tǒng)計(jì)分析模型的R~2X(cum)為0.87,R~2Y(cum)為0.712,Q~2(cum)為0.73。通過機(jī)器學(xué)習(xí)方法,篩選神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為MRSA與MSSA的分類器,預(yù)測模型的受試者曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)的AUC值為98.6%,對(duì)樣本預(yù)測的符合率達(dá)95.9%,基于OPLS-DA與機(jī)器學(xué)習(xí)方法篩選了MRSA與MSSA的差異特征,兩種方法篩選的結(jié)果可相互補(bǔ)充。2.本研究基于AgNPs~+膠體溶液的SERS的檢測方法,結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析和機(jī)器學(xué)習(xí)方法,一方面,有望為病原菌的快速鑒定和耐藥性分析提供了新方法。另一方面,初步分析差異特征,為臨床耐藥菌株差異分子的歸屬、差異分子的生物學(xué)解釋提供數(shù)據(jù)支持。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：

圖 1-1. 細(xì)菌感染的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法速檢測病原菌的研究現(xiàn)狀器具有制備成本低、操作簡便、檢測快速、高靈敏度、強(qiáng)點(diǎn)，其在生物醫(yī)學(xué)檢測、食品安全、藥物檢驗(yàn)等領(lǐng)域具有幾十年，研究者在生物傳感器應(yīng)用于病原菌快速檢測方面器在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究旨在滿足臨床病原菌早期、物傳感器可以定義為一種分析檢測設(shè)備，將生物分子響應(yīng)等可探測的信號(hào)。生物傳感器主要有生物識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)包括抗體，酶、核酸、適配體、噬菌體、細(xì)胞器、微生物件可特異識(shí)別目標(biāo)生物分子。三種主要的生物識(shí)別元件是元件的成功組裝是保障生物傳感器特異性的關(guān)鍵。生物元

. 生物傳感器的組成和分類。包括電化學(xué)（Electrochemical）、光學(xué)（Optical）和基（Mass-based）等不同種類傳感器[7]、光譜學(xué)技術(shù)在病原菌檢測應(yīng)用方面的研究現(xiàn)狀學(xué)生物傳感器在病原菌檢測應(yīng)用領(lǐng)域已有廣泛的報(bào)道。由于光學(xué)生物傳、特異性和相對(duì)快速的檢測的優(yōu)點(diǎn)而受到極大關(guān)注。 除此之外，通過光換能器對(duì)生物樣本檢測已實(shí)現(xiàn)可視化檢測。基于光學(xué)的檢測技術(shù)主要分為標(biāo)記和有標(biāo)記檢測。根據(jù)檢測原理，光學(xué)生物傳感器可進(jìn)一步分類為表（surface plasmon resonance, SPR）、比色傳感器、SERS、熒光和化學(xué)發(fā)是基于吸收，反射，折射和色散等光學(xué)參數(shù)而獲得。不同種類光學(xué)傳感eus 檢測的靈敏度、線性范圍如表 1-4 所示�；�于光學(xué)檢測病原菌的方法中，SPR、比色、熒光等檢測方法研究最為廣由入射光在正介電常數(shù)材料和負(fù)介電常數(shù)材料之間的界面產(chǎn)生的振蕩現(xiàn)于共振角的變化導(dǎo)致吸收光波長的變化。當(dāng)目標(biāo)分析物結(jié)合在傳感器表面

圖 2-1. 1990 年 1 月到 2019 年 1 月在 pubmed 發(fā)表的 SERS 相關(guān)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)a）局部表面等離子共振（LSPR）效應(yīng)的圖示；（b）真空中半徑為 35 納米消光效率[33]S 檢測包括直接檢測和間接檢測兩種方法，如圖 2-3 所示[34]。通過
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 張義紅;許文靜;楊坤;;電化學(xué)生物傳感器的研究進(jìn)展[J];集成技術(shù);2014年05期

2 顧兵;李永軍;;基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在臨床微生物鑒定中的應(yīng)用及價(jià)值[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2013年11期

3 王浩竹;王正祥;;細(xì)菌分子鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年23期

4 魏麗莉;;細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性的研究進(jìn)展[J];生物學(xué)教學(xué);2007年09期

本文編號(hào)：2893305