失血性休克是臨床常見的危重癥，經歷休克和復蘇存活的患者往往會發(fā)生難以控制的系統(tǒng)性炎癥反應致終末器官損傷。肺是最易受累器官之一，研究表明多種因素導致失血性休克后急性肺損傷(acutelung injury，ALI)的發(fā)生，其中炎癥介質在休克后ALI和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory dis—tress syndrome，ARDS)的發(fā)生中發(fā)揮關鍵作用，并成為該類患者死亡的主要原因 。本實驗通過復制失血性休克大鼠模型，觀察c肽對失血性休克大鼠血漿中促炎性細胞因子表達以及肺炎癥反應程度的影響，探討其發(fā)生機制，為探尋新的治療策略提供思路。

　　1 材料與方法

　　1．1 動物來源與分組 雄性Wistar大鼠(3～4月齡，體重300～350 g，浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供)，隨機分為3組，每組8只。假手術組(Sham組)：麻醉后實施手術但未失血和復蘇；乳酸鈉林格液復蘇組(RL組)：麻醉后實施手術，失血致休克，予以乳酸林格液復蘇；C肽復蘇組(c肽組)：麻醉后實施手術，失血致休克，予以C肽復蘇。

　　1．2 動物模型制作 2％戊巴比妥鈉50 mg／kg腹腔注射麻醉，分離一側股動、靜脈并置人套管，股動脈套管監(jiān)測平均動脈壓及留作放血，股靜脈套管注入復蘇液體和放出的血液，放出的血液儲存于無菌加肝素的容器中備用。所有實施手術后的大鼠觀察10 min以達到穩(wěn)態(tài)(大鼠血流動力學狀態(tài)平穩(wěn)并有自主呼吸)。以0．5 mL／min速度股動脈放血至平均動脈壓(MAP)降為(40～50 mmHg，40±5 mmHg)，維持此血壓，期間根據(jù)MAP的波動情況放出或回輸血液使MAP維持于此范圍內。1h后迅速復蘇。

　　RL組：乳酸林格液于30 min內輸入(總容量等于總失血量)；C肽組：1 mg／kg C肽溶于生理鹽水于30 min內輸入(總容量等于總失血量)；Sham組大鼠僅作動靜脈置管并維持測壓狀態(tài)同樣時程。各組分別于復蘇2h后經股動脈采血2 mL，離心后取上清于一70℃ 凍存。放血處死大鼠。部分肺組織固定于福爾馬林用于組織學分析。實驗過程中應用Ma．clab生物信號采集系統(tǒng)監(jiān)測心率和血壓。

　　1．3 實驗室檢測 各組在麻醉、插管結束后穩(wěn)定10 min，記錄基礎MAP，在休克模型建立及復蘇期間每30 min重復記錄一次；采用ONE TOUCH2 LIFES—CAN血糖自動分析儀測定血糖水平；采用ELISA法測定血漿白細胞介素一1(IL一1)、白細胞介素一6(IL一6)、腫瘤壞死因子一 (TNF—d)水平。所有試劑均購自武漢博士德公司。

　　Westing-blot檢測肺組織核轉錄因子(NF—KB)蛋白表達水平：肺組織加入細胞裂解液于勻漿器中勻漿后提取總蛋白，筆耕論文新浪博客，考馬斯亮藍法測定樣品總蛋白含量。蛋白質按SDS．PAGE電泳分離，BioRad電轉移裝置電轉移蛋白至硝基纖維素膜，麗春紅可逆染色確定蛋白Mark位置，依次加一抗、二抗，TTBS洗膜，BCIP／NBT顯色、拍照。各蛋白的相對含量以目的蛋白與內參照B一肌動蛋白(3-actin)蛋白表的灰度比值表示。

　　采分光光度計法測定肺組織髓過氧化物(MPO)活性。

　　1．4 肺組織學分析 取肺組織固定于4％ 中性福爾馬林，脫水、石蠟包埋、切片，HE染色。高倍鏡下觀察肺組織的病理改變。

　　1．5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件包進行分析。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，三組間比較采用方差分析；所有統(tǒng)計分析均采用雙側檢驗，P<0．05為有統(tǒng)計學意義。

　　2 結 果

　　2．1 各組MAP變化各組初始狀態(tài)(0 min)MAP沒有差異，平均值在130 mmHg左右。模型復制后RL組、c肽組(30～60 min)MAP穩(wěn)定于45±5 mm—Hg，Sham組不變。復蘇后2 h，C肽組MAP明顯高于RL組(t= 一11．07，P<0．01)。

　　2．2 血糖水平、血漿IL一1、IL一6、TNF． 水平、肺組織MPO含量及NF—KB蛋白的表達結果顯示，三組血糖水平無差異(P>0．05)；與Sham組相比較，c肽組與RL組肺組織MPO活性均升高(P<0．O1)，血漿IL一1、IL一6、TNF- 水平顯著升高(P<0．01)，肺組織NF-KB蛋白表達增加(P<0．01)；C肽組與RL組相比，肺組織MPO活性、血漿IL一1、IL一6、TNF一0水平、肺組織NF-KB蛋白表達均明顯降低(P<0．01)。

　　2．3 肺組織病理學變化 RL組肺組織肺泡壁增厚，肺間質水腫，肺泡腔內有大量的紅細胞及中性粒細胞浸潤；C肽組肺組織炎性細胞浸潤明顯減少，肺間質和肺泡病理改變明顯減輕。

　　3 討 論失血性休克復蘇后發(fā)生嚴重的系統(tǒng)性炎癥反應是導致ALI和ARDS的主要原因。近年研究發(fā)現(xiàn)，胰島素原分子的裂解產物c肽與細胞膜G蛋白偶聯(lián)受體特異性結合后可產生多種細胞內效應，改善器官和細胞的功能，發(fā)揮調節(jié)和保護作用。

　　MPO是反映呼吸系統(tǒng)炎癥和損傷的一個良好指標，與中性粒細胞的聚集程度有關。本研究結果發(fā)現(xiàn)，c肽組與RL組相比，肺組織MPO活性明顯降低，提示c肽可減輕失血性休克后中性粒細胞浸潤和肺損傷。病理學檢測也發(fā)現(xiàn)，RL組大鼠肺組織有典型病理學改變，表現(xiàn)為肺泡壁增厚、肺間質水腫、肺泡腔內有大量的紅細胞及中性粒細胞浸潤等，而C肽組上述病理改變則明顯減輕。我們認為，在失血性休克再灌注階段予以c肽可減輕肺組織損傷和炎癥反應，而這種保護作用可能與C肽調控內皮細胞粘附分子如P．選擇素、細胞間黏附分子1(ICAM一1)及血管細胞黏附分子一1(VCAM一1)的表達有關。Vish等 通過復制非DM嚙齒動物膿毒血癥模型，發(fā)現(xiàn)c肽可減輕肺間質、肺泡水腫，減輕肺泡損傷及炎性細胞浸潤，認為c肽參與調控炎性反應。Scalia等 研究發(fā)現(xiàn)，在腸系膜損傷的大鼠，c肽可減少腸系膜血管內皮細胞表面粘附分子P一選擇素及ICAM．1的表達，從而減輕白細胞滾動與粘附，減輕了血管損傷。而在非糖尿病(Diabetes mellitus，DM)動物如敗血癥和心肌缺血一再灌注損傷，c肽可介導白細胞與內皮胞間相互作用，調節(jié)一氧化氮(NO)生成及中性粒細胞浸潤，從而發(fā)揮抗炎作用 。因此C肽作為一重要的調控因子在失血性休克時可能抑制肺組織炎癥反應，減輕ALI。

　　由于ALI是肺組織失控性炎癥反應的結果，NF—KB作為一重要促炎轉錄因子，參與組織損傷、炎癥反應等。本研究發(fā)現(xiàn)c肽組NF．KB表達水平明顯低于RL組，提示C肽可能通過抑制NF．KB核轉位而弱化一些重要促炎介質如TNF—o、IL一1、IL一6等，減輕失血性休克后肺組織炎癥反應，減輕肺損傷。同時本研究中c肽組與RL組血漿TNF．IL．1、IL．6水平明顯高于Sham組，而與RL組相比，c肽組血漿TNF一0l、IL一1、IL一6水平明顯下降，從而進一步證實了c肽對炎癥的鈍化效應 。