馬鈴薯E3泛素StPUB17靶標(biāo)StKH17在晚疫病抗性中的功能研究
發(fā)布時間：2020-11-08 10:54
馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是中國第四大糧食作物,生產(chǎn)過程中會受到多種病蟲害的危害,嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。其中由卵菌致病疫霉菌(Phytophthora infestans(Mont.)De Bary.)引起的晚疫病是危害最嚴(yán)重的病害。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)馬鈴薯U-box類E3泛素連接酶StPUB17可以正調(diào)控晚疫病的抗性。通過酵母篩庫得到一個互作蛋白為StKH17,是一個含有KH-domain的RNA結(jié)合蛋白,在本氏煙中初步鑒定是一個抗性負調(diào)控因子。本研究旨在通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得超量和干涉StKH17馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株,驗證其在晚疫病抗性中的功能;以StKH17為誘餌通過酵母雙雜交篩庫篩選與其互作的靶標(biāo)蛋白;獲得穩(wěn)定表達StKH17和myc融合蛋白轉(zhuǎn)基因株系,為下一步利用Chip-seq技術(shù)研究StKH17調(diào)控的RNA靶標(biāo)打下基礎(chǔ)。取得的主要研究結(jié)果如下:1、構(gòu)建了StKH17超量表達和RNAi干涉載體,通過遺傳轉(zhuǎn)化成功獲得了2個超量表達和6個干涉馬鈴薯株系;晚疫病菌接種鑒定表明,超量表達StKH17降低晚疫病抗性,而干涉StKH17增強晚疫病抗性,即StKH17負調(diào)控馬鈴薯晚疫病的抗性。2、蛋白結(jié)構(gòu)分析表明StKH17具有2個保守的結(jié)構(gòu)域,一個為STAR-domain,另一個為KH-domain。酵母自激活和點對點互作驗證表明,StKH17與StPUB17的互作需要STAR-domain,缺失STAR-domain對于酵母自激活效應(yīng)沒有影響;而KH-domain對于酵母自激活效應(yīng)很重要,但其缺失對于StKH17與StPUB17的互作沒有影響。3、以StKH17~(△128-261)為誘餌從酵母文庫中篩選到3個候選互作蛋白,一個為StKH17自身,另一個為StKH17-2,還有一個為StKH17-3,酵母點對點互作驗證表明StKH17-2和StKH17-3與StKH17~(△128-261)特異互作,而不與StPUB17互作。4、構(gòu)建了破壞RNA結(jié)合能力的StKH17(GDDG)突變體載體,在本氏煙中瞬時表達時,發(fā)現(xiàn)其不能促進晚疫病菌的侵染。表明GDDG domain對StKH17發(fā)揮功能十分重要。5、構(gòu)建了StKH17-myc蛋白標(biāo)簽載體并通過馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化,獲得11個轉(zhuǎn)基因株系,Western Blot檢測到了3個株系穩(wěn)定的表達了StKH17和3×myc融合蛋白。本研究初步回答了StPUB17可能是通過降解負調(diào)控感病因子StKH17從而實現(xiàn)正調(diào)控馬鈴薯晚疫病抗性的假設(shè)。另外本研究結(jié)果表明,StKH17可能以復(fù)合體的形式調(diào)控抗病防衛(wèi)相關(guān)基因的可變剪接從而發(fā)揮負調(diào)控晚疫病抗性的功能。本研究為構(gòu)建StPUB17-StKH17-靶標(biāo)蛋白互作模型,闡明StPUB17在馬鈴薯晚疫病抗性中的功能和分子機制奠定了良好基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.32
【部分圖文】：
51.2.2 馬鈴薯晚疫病垂直抗性和水平抗性在馬鈴薯抗病機制的研究過程中，人們普遍認為分別存在兩種抗性：一種是垂直抗性，又稱小種專化抗性，還有一種是水平抗性，根據(jù)研究人員的不同背景又可稱為數(shù)量抗性、田間持久抗性和非小種�；剐浴ｑR鈴薯垂直抗性是由植物攜帶的主效抗性 R 基因提供的，是一種特異的單基因控制并且由于病原菌高度的遺傳多樣性造成的低持久性抗性，表現(xiàn)為對一個或幾個圖 1.1 晚疫病菌效應(yīng)子調(diào)控植物免疫示意圖（Whisson et al., 2016）Fig 1.1 Schematic of P. infestans effectors regulate in plant immunity（Whisson et al., 2016）
泛素化修飾（Ubiquitination）途徑簡稱為 Ub 途徑或泛素/26S 蛋白酶體通路，是一種真核生物特有的、典型的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾。真核生物體內(nèi)絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)選擇性降解都是由泛素化修飾途徑控制和調(diào)節(jié)的，通過對某些生理代謝途徑上關(guān)鍵蛋白質(zhì)的特異降解，從而直接或間接地調(diào)控植物的生長與發(fā)育、衰老與死亡、抗病與抗逆等生命代謝過程（Sadanandom, 2012；Yee et al., 2009）。泛素蛋白酶體級聯(lián)反應(yīng)的過程：首先泛素激活酶 E1 利用 ATP 提供能量，通過把 Ub 一個 C 末端甘氨酸與 E1 一個保守的半胱氨酸形成巰基酯鍵結(jié)合在一起激活泛素 Ub 形成 E1-Ub 復(fù)合體，接下來 E1 被釋放，激活的 Ub 與泛素結(jié)合酶 E2 通過巰基酯鍵結(jié)合在一起形成 E2-Ub 復(fù)合體，接下來 E2 攜帶著激活的 Ub 與泛素連接酶 E3 形成 E2-Ub-E3-Substate 中間復(fù)合體，接下來 E2 上的 Ub 通過與蛋白底物Substrate 形成異肽鍵的方式不斷的結(jié)合到蛋白底物 Substrate 上形成多聚 Ub 鏈。最后被多聚 Ub 鏈標(biāo)記的蛋白底物 Substrate 會被 26S 蛋白酶體識別并把 Ub 鏈拆開形成自由的泛素 Ub，而蛋白底物 Substrate 將被分解為多肽片段（圖 1.2）。
遼儆?1300 多個可能編碼泛素連接酶的基因（Vierstra, 2009）。近期眾多研究顯示泛素蛋白酶體降解途徑在植物抗病中扮演著重要角色（圖1.3）。例如：擬南芥、煙草中 E3 連接酶 RAR1/SGT1 在 R 基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)起著至關(guān)重要的作用(Azevedo et al., 2002)；辣椒 RING 泛素連接酶 CaRING1 瞬時表達能夠引起細胞的程序性死亡，在擬南芥上超量表達能夠抑制 P.syringaepv 和 H.arabidopsidis 的侵染（Lee et al., 2011）；晚疫病菌效應(yīng)子 AVR3a 可以與馬鈴薯 U-box E3 連接酶 CMPG1 互作同時增加其穩(wěn)定性，在由 INF1 激發(fā)的細胞程序性死亡過程當(dāng)中 CMPG1 發(fā)揮核心的作用，效應(yīng)子 AVR3a 可以改變 E3 連接酶 CMPG1 的功能從而抑制由 INF1 引起的細胞程序性死亡促進了晚疫病菌的侵染（Bos et al.,2010）。水稻 SPL11 基因編碼的蛋白也是一個含有 U-box 和 ARM 結(jié)構(gòu)域的 E3 連接酶，它與 SPIN6 互作通過影響 SA 的合成進而影響植物的細胞程序性死亡，還能負調(diào)控 PAMPs 引發(fā)的信號傳導(dǎo)和 PTI 免疫途徑（Li et al., 2012; Liu et al., 2012）。擬南芥 PUB12 和 PUB13 也是包含 U-box 和 ARM 結(jié)構(gòu)域的 E3 連接酶，它們的作用底 物 是 LRR 類 受 體 激 酶 FLS2 （ FLAGELLIN-SENSING2 ） ， 在 BAK1（BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1-ASSOCIATEDRECEPTORKINASE1）參與下 PUB12/13 降解 FLS2 從而負調(diào)控植物的 PTI 信號途徑（Lu et al., 2011; O’Neill,2011）。擬南芥 U-box 類 E3 連接酶 PUB22 可以特異性降解胞外運輸復(fù)合體中的一個亞基 Exo70B2
【參考文獻】
本文編號：2874684
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.32
【部分圖文】：
51.2.2 馬鈴薯晚疫病垂直抗性和水平抗性在馬鈴薯抗病機制的研究過程中，人們普遍認為分別存在兩種抗性：一種是垂直抗性，又稱小種專化抗性，還有一種是水平抗性，根據(jù)研究人員的不同背景又可稱為數(shù)量抗性、田間持久抗性和非小種�；剐浴ｑR鈴薯垂直抗性是由植物攜帶的主效抗性 R 基因提供的，是一種特異的單基因控制并且由于病原菌高度的遺傳多樣性造成的低持久性抗性，表現(xiàn)為對一個或幾個圖 1.1 晚疫病菌效應(yīng)子調(diào)控植物免疫示意圖（Whisson et al., 2016）Fig 1.1 Schematic of P. infestans effectors regulate in plant immunity（Whisson et al., 2016）
泛素化修飾（Ubiquitination）途徑簡稱為 Ub 途徑或泛素/26S 蛋白酶體通路，是一種真核生物特有的、典型的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾。真核生物體內(nèi)絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)選擇性降解都是由泛素化修飾途徑控制和調(diào)節(jié)的，通過對某些生理代謝途徑上關(guān)鍵蛋白質(zhì)的特異降解，從而直接或間接地調(diào)控植物的生長與發(fā)育、衰老與死亡、抗病與抗逆等生命代謝過程（Sadanandom, 2012；Yee et al., 2009）。泛素蛋白酶體級聯(lián)反應(yīng)的過程：首先泛素激活酶 E1 利用 ATP 提供能量，通過把 Ub 一個 C 末端甘氨酸與 E1 一個保守的半胱氨酸形成巰基酯鍵結(jié)合在一起激活泛素 Ub 形成 E1-Ub 復(fù)合體，接下來 E1 被釋放，激活的 Ub 與泛素結(jié)合酶 E2 通過巰基酯鍵結(jié)合在一起形成 E2-Ub 復(fù)合體，接下來 E2 攜帶著激活的 Ub 與泛素連接酶 E3 形成 E2-Ub-E3-Substate 中間復(fù)合體，接下來 E2 上的 Ub 通過與蛋白底物Substrate 形成異肽鍵的方式不斷的結(jié)合到蛋白底物 Substrate 上形成多聚 Ub 鏈。最后被多聚 Ub 鏈標(biāo)記的蛋白底物 Substrate 會被 26S 蛋白酶體識別并把 Ub 鏈拆開形成自由的泛素 Ub，而蛋白底物 Substrate 將被分解為多肽片段（圖 1.2）。
遼儆?1300 多個可能編碼泛素連接酶的基因（Vierstra, 2009）。近期眾多研究顯示泛素蛋白酶體降解途徑在植物抗病中扮演著重要角色（圖1.3）。例如：擬南芥、煙草中 E3 連接酶 RAR1/SGT1 在 R 基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)起著至關(guān)重要的作用(Azevedo et al., 2002)；辣椒 RING 泛素連接酶 CaRING1 瞬時表達能夠引起細胞的程序性死亡，在擬南芥上超量表達能夠抑制 P.syringaepv 和 H.arabidopsidis 的侵染（Lee et al., 2011）；晚疫病菌效應(yīng)子 AVR3a 可以與馬鈴薯 U-box E3 連接酶 CMPG1 互作同時增加其穩(wěn)定性，在由 INF1 激發(fā)的細胞程序性死亡過程當(dāng)中 CMPG1 發(fā)揮核心的作用，效應(yīng)子 AVR3a 可以改變 E3 連接酶 CMPG1 的功能從而抑制由 INF1 引起的細胞程序性死亡促進了晚疫病菌的侵染（Bos et al.,2010）。水稻 SPL11 基因編碼的蛋白也是一個含有 U-box 和 ARM 結(jié)構(gòu)域的 E3 連接酶，它與 SPIN6 互作通過影響 SA 的合成進而影響植物的細胞程序性死亡，還能負調(diào)控 PAMPs 引發(fā)的信號傳導(dǎo)和 PTI 免疫途徑（Li et al., 2012; Liu et al., 2012）。擬南芥 PUB12 和 PUB13 也是包含 U-box 和 ARM 結(jié)構(gòu)域的 E3 連接酶，它們的作用底 物 是 LRR 類 受 體 激 酶 FLS2 （ FLAGELLIN-SENSING2 ） ， 在 BAK1（BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE1-ASSOCIATEDRECEPTORKINASE1）參與下 PUB12/13 降解 FLS2 從而負調(diào)控植物的 PTI 信號途徑（Lu et al., 2011; O’Neill,2011）。擬南芥 U-box 類 E3 連接酶 PUB22 可以特異性降解胞外運輸復(fù)合體中的一個亞基 Exo70B2
【參考文獻】
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本文編號：2874684
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