發(fā)布時間：2020-11-18 13:56

　　 菜青蟲(Pieris rapae)屬鱗翅目粉蝶科,嗜食十字花科的白菜、甘藍、油菜、蘿卜、花椰菜等蔬菜,是危害嚴重的農(nóng)業(yè)害蟲之一。中腸作為昆蟲消化器官的主要部位,能分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等多種消化酶參與消化食物,而營養(yǎng)物質(zhì)吸收是機體進行其他生命活動的基礎(chǔ)。因此,若我們了解菜青蟲食物消化機制,找到其中的關(guān)鍵消化酶,就能通過阻斷其物質(zhì)吸收來控制蟲害。本文利用高通量測序技術(shù)、分子生物學(xué)等方法研究菜青蟲受饑餓脅迫時轉(zhuǎn)錄譜變化,并挖掘消化相關(guān)基因;同時選取2個絲氨酸蛋白酶候選基因進行克隆、組織表達和異源表達研究。這些研究為進一步探索菜青蟲食物消化吸收機制和可能抗蟲靶點提供理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1.對菜青蟲正常和饑餓兩種狀態(tài)中腸樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序,共獲得的17.82Gb的數(shù)據(jù),51544條Unigene。經(jīng)NR、Swiss-Prot、Pfam、GO、COG、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫同源注釋發(fā)現(xiàn),共有22233條Unigene獲得注釋信息。對比兩個轉(zhuǎn)錄組,共獲得2682個差異表達基因,其中有1610個基因下調(diào),1072個基因上調(diào),有56個是高表達的差異表達基因。將差異表達基因經(jīng)NR、GO、COG、KOG、KEGG、Pfam和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫功能注釋發(fā)現(xiàn),在菜青蟲受到饑餓脅迫時,其物質(zhì)代謝活動、能量代謝活動、酶合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等受到明顯影響。2.基于中腸作為菜青蟲食物消化的主要場所,選擇對其表達的消化相關(guān)基因進行挖掘,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菜青蟲中腸中表達了80個絲氨酸蛋白酶,10個淀粉酶,42個脂肪酶,34個羧肽酶,未發(fā)現(xiàn)纖維素酶,其食物中纖維素可能依靠菜青蟲腸道菌進行消化。其中,在菜青蟲受到饑餓脅迫時,差異表達的淀粉酶和羧肽酶全部下調(diào),而絲氨酸蛋白酶和脂肪酶大部分下調(diào),少部分上調(diào),可能是為了減小體內(nèi)的能量消耗且保持機體基本活動,對食物消化相關(guān)基因進行了調(diào)控。3.對菜青蟲中腸轉(zhuǎn)錄組密碼子使用偏好性進行分析,為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),菜青蟲中腸密碼子使用整體偏好性程度不高,但不同基因之間存在明顯密碼子使用偏好性;菜青蟲中腸表達基因偏好以A/U結(jié)尾的密碼子,GAA,UUU,AAU,UAU 4個密碼子為其最優(yōu)密碼子;菜青蟲中腸表達的絲氨酸蛋白酶(胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶)在6種不同宿主中表達難度從大到小分別為:大腸桿菌B昆蟲High5細胞/哺乳動物HEK293S細胞煙草/畢赤酵母/擬南芥。4.克隆了一個胰凝乳蛋白酶基因PrCT1,該基因編碼區(qū)由861核苷酸組成,編碼286個氨基酸,含有典型的絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體(H_(57),D_(102)與S_(195)),經(jīng)絲氨酸蛋白酶底物特異性口袋的分析顯示屬于胰凝乳蛋白酶。它與黑脈金斑蝶(GenBank登錄號:OWR53227)胰凝乳蛋白酶的同源性最高,達到49%,且親緣關(guān)系最近。利用qRT-PCR檢測PrCT1基因在菜青蟲中轉(zhuǎn)錄發(fā)現(xiàn),它主要在菜青蟲中腸表達,且饑餓與決明胰蛋白酶抑制劑喂食處理后表達水平均下調(diào),推測其可能是菜青蟲中腸中發(fā)揮食物消化作用的重要蛋白酶,且可能是重要的抗蟲靶點。將PrCT1基因插入到原核表達載體pET28a,轉(zhuǎn)化Rosseta(DE3)進行原核表達發(fā)現(xiàn),PrCT1重組蛋白以包涵體形式表達;將PrCT1基因插入到真核表達載體pPIC9K,轉(zhuǎn)化畢赤酵母進行真核表達發(fā)現(xiàn),PrCT1基因能在畢赤酵母中轉(zhuǎn)錄,但僅在胞內(nèi)檢測到非常低的目的蛋白表達。5.克隆了一個胰蛋白酶基因PrT1,該基因編碼區(qū)由1206核苷酸組成,編碼401個氨基酸,含有典型的絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體(H_(57),D_(102)與S_(195)),經(jīng)絲氨酸蛋白酶底物特異性口袋的分析顯示屬于胰蛋白酶。它與臍橙螟(GenBank登錄號:XP_013191840)和蠟螟(GenBank登錄號:AXY94763)絲氨酸蛋白酶同源性最高,分別為61.32%、59.19%,且親緣關(guān)系最近。將PrT1基因插入到原核表達載體pET28a,轉(zhuǎn)化Rosseta(DE3)進行原核表達發(fā)現(xiàn),PrT1重組蛋白也以包涵體形式表達。再將PrT1重組蛋白皮下注射新西蘭兔制備多克隆抗體,經(jīng)Western Blot檢測抗體特異性較好。利用qRT-PCR和Western Blot檢測PrT1在菜青蟲不同組織部位表達發(fā)現(xiàn),qRT-PCR和Western Blot檢測結(jié)果基本一致,PrT1主要在菜青蟲中腸表達,其他部位(頭、尾、脂肪體)表達量非常低,同時在菜青蟲受到饑餓脅迫時,PrT1在菜青蟲中腸表達水平顯著升高。因此,我們推測胰蛋白酶PrT1可能在菜青蟲中腸參與食物消化,但其具體功能還需后續(xù)進一步研究才能了解。
【學(xué)位單位】：西南交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S433.4
【部分圖文】：

度：樣品濃度在250μg/μL以上，且總量大于30μg；整性：28S與18S亮度比大于等于1.5，且無拖尾現(xiàn)象。轉(zhuǎn)錄組測序百邁克生物科技有限公司確認 RNA 樣品合格后，采用 Illumina HiSe量測序平臺對菜青蟲兩個樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組序列組裝當(dāng)時沒有菜青蟲基因組，經(jīng)質(zhì)量過濾的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)采用 Trinity 軟因組的從頭合并組裝（de novo assembly）。Trinity 軟件首先將 Readser 打斷來成小片段，然后選擇頻率最高的 K-mer 作為種子向兩端進行tig，再利用 Contig 聚簇得到 Component，并構(gòu)建 De Bruijn 圖，最后ead 解開 De Bruijn 圖，獲得轉(zhuǎn)錄本序列（圖 2-1）。組裝完整后評估轉(zhuǎn)確保后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果可靠。

圖 2-2 菜青蟲中腸 RNA 瓊脂電泳序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果0 高通量測序技術(shù)對菜青蟲正常和饑轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) 17.82Gb，每個樣品 Q20續(xù)數(shù)據(jù)分析的準確性，將轉(zhuǎn)錄組測序錄組分別獲得 28,918,396 和 30,791,6表 2-2 樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計表正常 28,918,396 19,807,564 68.49% 93.14% 47.48%

圖 2-3 組裝 Unigene 長度分布4 轉(zhuǎn)錄組序列功能注釋 Unigene 序列比對到 NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG 數(shù)據(jù)233 條 Unigene 獲得注釋信息。其中 NR 數(shù)據(jù)庫共注釋 18814 條 Unigen與黑脈金斑蝶（Danaus plexippus）（6665，35.50%）和家蠶（Bombyx4，24.42%）有最大同源性；GO 數(shù)據(jù)庫共注釋 10725 條 Unigene，其中大類別分子功能、細胞組分和生物學(xué)數(shù)目分別為 13635（23.50%）、1744%）、27320（47.0%），而細胞組分中注釋最多的前 3個分別為細胞（cell）（%）、細胞組分（cell part）（3539，33.00%）、細胞器（2513，23.43%），釋最多前 3 個是催化活性（catalytic activity）（5536，51.62%）、結(jié)合（b4，49.55%）、轉(zhuǎn)運活性（transporter activity）(802,7.48%)，生物學(xué)過程 3 個是代謝過程（metabolic process（）6686，62.34%）、細胞過程（cellular
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本文編號：2888792