林煙草NsylCIPK家族成員的克隆及其與NsylCBL10的互作分析
發(fā)布時間：2020-06-14 20:56
【摘要】：植物中的類鈣調神經(jīng)素B亞基蛋白CBL(Calcineurin B-like protein)家族成員與其互作蛋白激酶CIPK(CBL-interacting kinase protein)家族成員形成了復雜精細的CBL-CIPK信號調控網(wǎng)絡,在解碼生物和非生物脅迫激發(fā)的鈣信號及信號的進一步傳導中發(fā)揮重要作用。CBL家族成員CBL10參與植物抵抗高鹽脅迫、應對病菌侵染、參與分生組織和花器官發(fā)育、調節(jié)離子平衡等多個過程,對其下游互作CIPK家族成員的篩選與鑒定對于明確上述調節(jié)機制至關重要。為了鑒定林煙草(Nicotiana sylvestris)NsylCBL10下游互作NsylCIPK家族成員,本研究首先以擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtCIPK家族成員和水稻(Oryza sativa)OsCIPK家族成員基因的CDS序列為檢索序列,利用NCBI和中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫對林煙草中可能存在的NsylCIPK家族成員進行了預測;然后通過RT-PCR方法對預測到的NsylCIPK家族成員進行了克隆并利用生物學分析軟件對其基因結構和蛋白保守結構域進行了分析;最后通過酵母雙雜交實驗鑒定了與NsylCBL10互作的NsylCIPK家族成員。結果表明,在林煙草中可能存在28個NsylCIPK家族成員,實際克隆獲得了20個NsylCIPK家族成員,在酵母雙雜交體系中與NsylCBL10互作的只有1個NsylCIPK家族成員NsylCIPK14a。通過PCR以及抗生素抗性篩選鑒定突變體,成功拿到NsylCBL2轉煙草突變體、NsylCBL2轉擬南芥突變體、擬南芥atcbl3突變體和擬南芥atcbl2atcbl3雙突變體。對這些突變體進行了種子發(fā)育和離子抗性的分析,結果表明NsylCBL2轉擬南芥和轉煙草的突變體沒有表現(xiàn)出和對照之間的明顯的差異。本研究為解析林煙草及其他物種中CBL-CIPK信號通路的調節(jié)功能提供了試驗數(shù)據(jù)。
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S572
【圖文】：
18圖 2.1 NsylCIPK 家族成員鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹分析Figure 2.1 Neighbor-joining phylogenetic tree of CIPK family members2.3.2 NsylCIPK 家族成員的克隆及結構分析根據(jù)預測的 28 個 NsylCIPK 家族成員的 CDS 序列設計引物，以林煙草 cDNA 為模板，克隆得到了其中的 20 個成員。由于擬南芥 AtCIPK 家族成員的功能研究更為深入，為了方便后續(xù)分析和研究，根據(jù)與 AtCIPK 家族成員在進化樹中親源關系的遠近對克隆獲得的 NsylCIPK 家族成員進行命名(表 2.9)。對克隆獲得的 20 個 NsylCIPK 家族成員的基因結構進行分析(圖 2.2)，結果表明，該家族成員可以根據(jù)基因結構分為兩類：第一類包括亞家族 Subgroup1、Subgroup2、Subgroup3 和 Subgroup4中的成員，都具有少內含子特征，僅含有 1~2 個外顯子；第二類包括 Subgroup5 中的成員，具有多內含子特征，含有 12~15 個外顯子。從進化關系上來看，少內含子成員位于進化樹的基部，表明進化初期 NsylCIPK 家族成員含內含子較少，后來逐漸進化出多內含子成員。
圖 2.2 獲得的 NsylCIPK 家族成員的進化和基因結構分析Figure 2.2 Phylogenetic analysis and gene structures of cloned NsylCIPK genes對克隆獲得的 20 個 NsylCIPK 家族成員的蛋白保守結構域進行分析(圖 2.3)，結果表明，克隆獲得的 NsylCIPK 家族所有成員都具有 DFG-APE 激活環(huán)結構域、NAF 結構域和 PPI 結構域。說明這三個結構域在 NsylCIPK 家族成員的進化中非常保守，由此可推測它們在 NsylCIPK 發(fā)揮正常功能的過程中發(fā)揮重大作用。
本文編號：2713347
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S572
【圖文】：
18圖 2.1 NsylCIPK 家族成員鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹分析Figure 2.1 Neighbor-joining phylogenetic tree of CIPK family members2.3.2 NsylCIPK 家族成員的克隆及結構分析根據(jù)預測的 28 個 NsylCIPK 家族成員的 CDS 序列設計引物，以林煙草 cDNA 為模板，克隆得到了其中的 20 個成員。由于擬南芥 AtCIPK 家族成員的功能研究更為深入，為了方便后續(xù)分析和研究，根據(jù)與 AtCIPK 家族成員在進化樹中親源關系的遠近對克隆獲得的 NsylCIPK 家族成員進行命名(表 2.9)。對克隆獲得的 20 個 NsylCIPK 家族成員的基因結構進行分析(圖 2.2)，結果表明，該家族成員可以根據(jù)基因結構分為兩類：第一類包括亞家族 Subgroup1、Subgroup2、Subgroup3 和 Subgroup4中的成員，都具有少內含子特征，僅含有 1~2 個外顯子；第二類包括 Subgroup5 中的成員，具有多內含子特征，含有 12~15 個外顯子。從進化關系上來看，少內含子成員位于進化樹的基部，表明進化初期 NsylCIPK 家族成員含內含子較少，后來逐漸進化出多內含子成員。
圖 2.2 獲得的 NsylCIPK 家族成員的進化和基因結構分析Figure 2.2 Phylogenetic analysis and gene structures of cloned NsylCIPK genes對克隆獲得的 20 個 NsylCIPK 家族成員的蛋白保守結構域進行分析(圖 2.3)，結果表明，克隆獲得的 NsylCIPK 家族所有成員都具有 DFG-APE 激活環(huán)結構域、NAF 結構域和 PPI 結構域。說明這三個結構域在 NsylCIPK 家族成員的進化中非常保守，由此可推測它們在 NsylCIPK 發(fā)揮正常功能的過程中發(fā)揮重大作用。
【相似文獻】
相關碩士學位論文 前3條
1 許迪之;林煙草NsylCIPK家族成員的克隆及其與NsylCBL10的互作分析[D];中國農業(yè)科學院;2018年
2 毛靜靜;林煙草NsylCBL10和NsylCBL5的功能研究[D];中國農業(yè)科學院;2017年
3 董連紅;林煙草CBL基因家族成員NsylCBL10的功能分析[D];中國農業(yè)科學院;2015年
本文編號：2713347
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