發(fā)布時(shí)間：2020-06-16 19:32

【摘要】：甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)是我國(guó)重要的油料作物,不僅可生產(chǎn)食用油,而且其餅粕富含蛋白質(zhì),也可作為動(dòng)物飼料。種子大小(千粒重)是產(chǎn)量的重要決定因素之一,尋找并研究控制種子大小的基因及其功能性SNPs對(duì)促進(jìn)分子設(shè)計(jì)育種的發(fā)展、提高油菜籽產(chǎn)量具有深遠(yuǎn)的意義。本研究基于具有324個(gè)油菜種質(zhì)資源的自然群體,對(duì)甘藍(lán)型油菜生長(zhǎng)調(diào)控因子家族(growth regulating-factors,GRFs)中的35個(gè)基因進(jìn)行了千粒重的關(guān)聯(lián)分析,檢測(cè)到33個(gè)與種子千粒重顯著相關(guān)的SNPs位點(diǎn),這些SNPs位點(diǎn)主要分布于BnaC02g44780D基因區(qū)域,由于它是生長(zhǎng)調(diào)控因子7中的一個(gè)基因,我們將它命名為BnGRF7c。本研究以BnGRF7c為切入點(diǎn),對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、生物學(xué)特征分析、表達(dá)譜分析和功能驗(yàn)證等方面的研究,本研究的主要結(jié)果如下:(1)本研究從具有324個(gè)油菜種質(zhì)資源的自然群體中,分別選擇千粒重大的材料(4.17~5.52g)和千粒重小的材料(2.83~3.55g)作為分組,采用三種方法,即Fst(Fixation index)分析、θPi分析和Tajima’D分析,對(duì)BnGRF7c進(jìn)行選擇壓力分析。結(jié)果顯示BnGRF7c在育種過(guò)程中受到了正選擇,推測(cè)其可能是油菜育種中一個(gè)至關(guān)重要的功能基因。組織特異性表達(dá)模式分析結(jié)果表明,BnGRF7c在油菜莖尖和發(fā)育中的種子中的表達(dá)水平較高,與關(guān)聯(lián)分析結(jié)果在一定程度上相吻合,證實(shí)BnGRF7c與種子發(fā)育有關(guān)。(2)構(gòu)建了pK7FWG2.0-BnGRF7c-eGFP植物融合表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)BnGRF7c編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,結(jié)果顯示BnGRF7c蛋白分布于煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中,與預(yù)測(cè)結(jié)果相一致,表明它在油菜的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中以轉(zhuǎn)錄因子的身份發(fā)揮作用,調(diào)控油菜的生長(zhǎng),從而影響油菜的種子大小。(3)構(gòu)建了pBI121-BnGRF7c過(guò)表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥,經(jīng)篩選得到陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。過(guò)表達(dá)植株表型調(diào)查結(jié)果表明,與野生型相比,其葉片面積、花瓣面積、角果長(zhǎng)度和種子大小均明顯增加,證實(shí)BnGRF7c確實(shí)可以調(diào)控種子大小。為進(jìn)一步驗(yàn)證BnGRF7c基因的功能,使用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)BnGRF7c基因進(jìn)行敲除,然后利用下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化體系將基因敲除載體BnGRF7c-Cas9轉(zhuǎn)化到甘藍(lán)型油菜中,并針對(duì)不同的油菜品種將轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了相應(yīng)優(yōu)化,經(jīng)篩選鑒定已獲得陽(yáng)性株,其功能有待于后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證。研究結(jié)果表明,BnGRF7c蛋白定位于細(xì)胞核中,在油菜的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中以轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的身份發(fā)揮作用,推測(cè)其可能以參與細(xì)胞分裂調(diào)控的方式來(lái)影響油菜的種子發(fā)育,從而調(diào)控油菜的種子大小。篩選到幾個(gè)在具有大種子的油菜種質(zhì)中呈現(xiàn)較強(qiáng)規(guī)律性的SNPs位點(diǎn),通過(guò)PCR反應(yīng)程序優(yōu)化,檢測(cè)到SNP chrC02_random_566683位點(diǎn)可用于油菜分子設(shè)計(jì)育種中大量樣本的篩選。上述研究結(jié)果不僅揭示了植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與植物生長(zhǎng)過(guò)程及種子發(fā)育之間的關(guān)系,為研究植物種子發(fā)育提供理論依據(jù),同時(shí)對(duì)植物種子大小的遺傳改良、高產(chǎn)油菜品種的選育也具有重要的指導(dǎo)意義。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S565.4
【圖文】：

BnGRF7c 基因的功能研究及其 SNP 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)表 1.1 (續(xù))Table 1.1 (continued)途徑 蛋白名稱 物種名稱蛋白質(zhì)類別 功能喪失的表型參考文獻(xiàn)HvDep1 大麥 G 蛋白 γ 亞基的同源基因 小谷粒[49]轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BS1 豆科 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 大種子 [50]GW8 水稻 SBP 家族轉(zhuǎn)錄因子；OsSPL16 窄谷粒 [51]GS2 水稻 生長(zhǎng)調(diào)控因子 4 小谷粒 [52;53]OsGIF1 水稻 GRF 互作蛋白 1 小谷粒 [54]SOD7 擬南芥 B3 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄抑制因子 大種子 [53]NGAL3 擬南芥 B3 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄抑制因子 大種子 [56]

般 Fst 值越大，表明兩個(gè)亞組分化越嚴(yán)重，從而說(shuō)明該區(qū)域在兩個(gè)亞組中發(fā)生明顯分化，則該區(qū)域?yàn)榉N子大小的受選擇區(qū)域。(2) θPi 分析，窗口 20 kb，步長(zhǎng) 2 kb，計(jì)算兩組材料的遺傳多樣性 Pi，如果兩組材料某個(gè)區(qū)域的 Pi 差異顯著，則比值會(huì)偏高或偏低，說(shuō)明該區(qū)域受選擇。(3) Tajima’s D 分析，是基于群體中性進(jìn)化的分析，窗口 20 kb，沒(méi)有步長(zhǎng)，若Tajima’sD 值大于 0，顯示有很多中頻等位基因出現(xiàn)在這個(gè)窗口，可推測(cè)為平衡選擇；若 Tajima’sD 值小于 0，顯示有很多低頻等位基因出現(xiàn)在這個(gè)窗口，可推測(cè)為定向選擇�？傊�，Tajima’s D 值越偏離 0，受選擇程度越高。雖然三種分析方法的窗口均為 20 kb，而且其中 Tajima’s D 分析沒(méi)有步長(zhǎng)，但是如圖 2.1 所示，BnGRF7c 基因上游 22 kb 及下游 8 kb 區(qū)域內(nèi)無(wú)其他基因(來(lái)源于數(shù)據(jù)庫(kù) GENOSCOPE)，因此可以排除干擾。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 夏天;李娜;李云海;;植物種子和器官大小調(diào)控研究取得新進(jìn)展[J];遺傳;2013年10期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 夏天;李杰;李勝軍;李云海;;DA1和DA2協(xié)同調(diào)控植物種子和器官大小[A];2010全國(guó)植物生物學(xué)研討會(huì)論文集[C];2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王杰利;甘藍(lán)型油菜過(guò)量表達(dá)BnOLE引起種子和器官變大的研究[D];江蘇大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2716476