發(fā)布時間：2020-06-18 03:05

【摘要】：本研究以玉米骨干自交系為材料,采用穿膜肽介導(dǎo)的花粉管導(dǎo)入技術(shù)對幾種重要玉米骨干自交系中的乙酰乳酸合成酶ALS基因進(jìn)行了定點突變的基因編輯研究,旨在初步建立不依賴于基因型的玉米基因編輯技術(shù)體系,為玉米分子育種奠定基礎(chǔ)。通過大規(guī)模苗期除草劑篩選,得到了抗苯磺隆的后代植株,靶點測序結(jié)果初步證實了通過花粉管導(dǎo)入DNA可實現(xiàn)基因定點編輯,且ALS基因的定點突變可用于除草劑抗性篩選。用編輯后的除草劑抗性基因作為篩選標(biāo)記,極大提高了花粉管導(dǎo)入法基因編輯后代的鑒定效率。為了在培育抗除草劑突變體材料過程中選擇合適的受體材料及除草劑篩選濃度,以7個玉米骨干自交系C92、京724、京2416、B73、鄭58、HZ178和178為材料,研究了各自交系材料對苯磺隆和甲咪唑煙酸的敏感性差異。測定不同除草劑濃度處理下各自交系的初生根長受抑制率、幼苗生長受抑制率和乙酰乳酸合成酶(ALS)活性。結(jié)果顯示:隨著兩種除草劑處理濃度的增加,各自交系材料的初生根長受抑制率和幼苗生長受抑制率明顯提高,且各自交系材料ALS酶活性存在不同程度的下降趨勢;7個自交系材料對兩種除草劑的敏感性高低均為:C92京724京2416B73鄭58HZ178178;相比較苯磺隆各自交系材料對甲咪唑煙酸更加敏感。綜上所述,自交系C92、京724和京2416相比較B73、鄭58、178和HZ178對苯磺隆及甲咪唑煙酸更加敏感,適合作為ALS基因編輯獲得抗除草劑突變體的受體材料,苯磺隆和甲咪唑煙酸的篩選濃度分別為334mg/L與120mg/L。試驗采用花粉管導(dǎo)入法將編輯玉米ALS基因的質(zhì)粒載體(pBUE911)導(dǎo)入玉米自交系。通過除草劑苯磺隆(334mg/L)篩選獲得22株T_0代抗性株系,分子檢測及測序驗證證明ALS基因靶點得到了定點突變,對突變體自交后代靶位點測序分析,證實編輯突變情況可以有效遺傳。試驗選出抗性較強(qiáng)的7個T2代突變體株系,對其苯磺隆抗性、乙酰乳酸合成酶(ALS)活性進(jìn)行了鑒定和測量。結(jié)果顯示:在除草劑苯磺隆處理下,與對照相比,發(fā)現(xiàn)不同時期突變株系的根長、側(cè)根數(shù)、鮮干重、株高、莖粗及葉面積等相關(guān)形態(tài)學(xué)指標(biāo)明顯增加,表現(xiàn)出較好生長狀況,并且突變體中乙酰乳酸合成酶活性無明顯下降。以上結(jié)果表明ALS基因靶位點經(jīng)過基因編輯定點突變后,部分編碼氨基酸發(fā)生改變,使其與對照自交系相比能夠?qū)�ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生一定抗性。
【學(xué)位授予單位】：長江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S513
【圖文】：

3.3 結(jié)果與分析.3.1 基因編輯表達(dá)載體構(gòu)建酶切驗證.3.1.1 質(zhì)粒載體pBUE911與pEasy-blunt酶切圖載體經(jīng)過熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取質(zhì)粒，用內(nèi)切酶BsaI對pBUE911，將壯觀霉素抗性基因SpR切下，片段大小為1218bp，回收大片段；用indⅢ對pEasy-blunt進(jìn)行酶切，切下片段大小為546bp，回收大片段，酶如下所示。

3.3.1.1 質(zhì)粒載體pBUE911與pEasy-blunt酶切圖載體經(jīng)過熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取質(zhì)粒，用內(nèi)切酶BsaI對pBUE91切，將壯觀霉素抗性基因SpR切下，片段大小為1218bp，回收大片段；用HindⅢ對pEasy-blunt進(jìn)行酶切，切下片段大小為546bp，回收大片段，酶圖如下所示。圖 3-1 質(zhì)粒 pBUE911 酶切Fig.3-1 plasmid pBUE911 Enzyme Cutting

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本文編號：2718593