發(fā)布時間：2020-12-12 14:34

　　草魚養(yǎng)殖作為我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的漁業(yè)產(chǎn)業(yè)為滿足人類的蛋白食品需求提供了重要保障,但是長期以來的高密度養(yǎng)殖方式造成了草魚出血病的頻繁暴發(fā)并引起巨大的經(jīng)濟損失。目前草魚出血病的疫苗防治研究雖取得了較大進展,但草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）頻繁變異和疫苗商業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用瓶頸制約了病害防治研究應(yīng)用進程,采用藥物進行防治目前尚為大規(guī)模防治草魚出血病的最為直接有效的途徑。因此,抗病毒藥物開發(fā)以及相關(guān)機制研究在草魚出血病防治領(lǐng)域顯得尤為重要。鹽酸嗎啉胍（Moroxydine hydrochloride,Mor）作為雙胍結(jié)構(gòu)藥物因缺乏確切的藥理學(xué)和毒理學(xué)研究證據(jù)在1999年被國家宣布停用,該藥物一直以來未受重視。本研究前期發(fā)現(xiàn)Mor具有良好的抗GCRV活性,因此在對其進行安全性進行檢測前提下,進一步對Mor的抗病毒和抗細胞凋亡等機制進行研究。取得結(jié)果如下:1.Mor體外抗GCRV活性研究通過借助體外抗病毒藥物篩選模型,發(fā)現(xiàn)Mor對四株水產(chǎn)病毒感染下的體外培養(yǎng)細胞起到了不同程度的保護作用,尤其是在100μg mL-1的初篩試驗中實現(xiàn)了對感染兩株GCRV病毒的草魚腎細胞（... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 GCRV研究歷史
    1.2 草魚出血病的流行病學(xué)概況
    1.3 GCRV生物學(xué)研究
        1.3.1 GCRV形態(tài)特征
        1.3.2 GCRV理化特性
        1.3.3 GCRV的細胞培養(yǎng)及感染特性
        1.3.4 GCRV的一般生物學(xué)特征
        1.3.5 GCRV轉(zhuǎn)錄和翻譯
    1.4 GCRV的檢測
    1.5 病毒感染對宿主影響研究
        1.5.1 水產(chǎn)動物病毒與宿主細胞的關(guān)系
        1.5.2 GCRV與宿主細胞的相互關(guān)系
    1.6 草魚出血病病害防控技術(shù)研究
        1.6.1 草魚出血病疫苗免疫
        1.6.2 草魚機體免疫抗GCRV研究
        1.6.3 基因干擾技術(shù)抑制草魚出血病
        1.6.4 草魚出血病的生態(tài)防控
        1.6.5 草魚出血病藥物防控
    1.7 Mor抗病毒研究
        1.7.1 Mor概述
        1.7.2 Mor特性
        1.7.3 Mor研究進展
    1.8 藥物抗病毒途徑的相互關(guān)系
    1.9 選題目的及意義
第二章 Mor體外抗GCRV活性研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 細胞、病毒和化合物
        2.1.2 主要細胞培養(yǎng)基及溶液的配制
        2.1.3 細胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)
        2.1.4 病毒擴增與滴度
        2.1.5 Mor抗病毒處理后對細胞活力檢測
        2.1.6 藥物對細胞的安全性檢測
        2.1.7 Mor在CIK細胞的藥物代謝檢測
        2.1.8 Mor抗GCRV病毒對宿主細胞的形態(tài)學(xué)檢測
        2.1.9 Mor抗GCRV病毒效果的濃度梯度檢測
        2.1.10 Mor處理后對病毒滴度的檢測
        2.1.11 Mor處理后對病毒基因表達的檢測
        2.1.12 Mor處理后對GCRV病毒蛋白表達的檢測
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 Mor對GCRV病毒的體外抗病毒活性
        2.2.2 Mor對細胞的急性毒性
        2.2.3 Mor在CIK細胞內(nèi)的代謝作用
        2.2.4 Mor抗GCRV病毒對宿主細胞的形態(tài)學(xué)檢測
        2.2.5 Mor抗GCRV的濃度梯度檢測結(jié)果
        2.2.6 Mor處理后對病毒滴度的影響
        2.2.7 Mor處理后對病毒基因表達的影響
        2.2.8 Mor對GCRV病毒蛋白表達的抑制
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 Mor在體抗GCRV研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 藥物對草魚的安全性
        3.1.3 病毒攻毒及藥物處理
        3.1.4 Mor抗病毒效果檢測
        3.1.5 Mor抗病毒過程中對草魚血液酶活檢測
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 Mor對草魚的急性毒性
        3.2.2 Mor處理后對草魚死亡率的保護
        3.2.3 藥物浸泡和注射下對草魚組織內(nèi)GCRV的檢測
        3.2.4 藥物注射處理下對草魚相關(guān)生理指標測定
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 Mor抑制GCRV蛋白表達
    4.1 材料與方法
        4.1.1 GCRV104病毒VP6目的基因擴增與回收
        4.1.2 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
        4.1.3 重組表達載體的構(gòu)建與鑒定
        4.1.4 Mor對重組質(zhì)粒在CIK細胞內(nèi)的表達的熒光檢測
        4.1.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CIK細胞后對宿主細胞活力的檢測
        4.1.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CIK細胞后對宿主凋亡的流式細胞檢測
        4.1.7 Mor對重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CIK細胞后VP6表達的影響
    4.2 實驗結(jié)果與分析
        4.2.1 GCRV病毒VP6基因的擴增與鑒定
        4.2.2 VP6基因真核表達載體酶切和測序鑒定
        4.2.3 Mor 作用下對重組質(zhì)粒在 CIK 細胞內(nèi)表達的影響
        4.2.4 pIRES2-AcGFP1-VP6轉(zhuǎn)染后對CIK細胞活力的影響
        4.2.5 pIRES2-AcGFP1-VP6轉(zhuǎn)染后對CIK細胞凋亡的影響
        4.2.6 Mor 對轉(zhuǎn)染細胞內(nèi) VP6 表達的影響
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第五章 Mor抗CIK細胞凋亡機制研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 Mor處理后對防止細胞核損傷的檢測
        5.1.2 Mor處理后對防止DNA損傷的分子檢測
        5.1.3 Mor對細胞表面超微結(jié)構(gòu)的檢測
        5.1.4 Mor抑制GCRV粒子在細胞內(nèi)的復(fù)制以及抗凋亡檢測
        5.1.5 凋亡抑制劑作用下的細胞活力檢測
        5.1.6 分光光度法檢測Caspase 3 的相對活性
        5.1.7 Caspase- 9、-3 的Western-blot檢測
        5.1.8 GCRV感染對Bax和Bcl-2 蛋白表達的檢測
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 Mor處理后對防止細胞核損傷的檢測
        5.2.2 Mor處理后對防止DNA斷裂的檢測
        5.2.3 Mor處理后對細胞表面形態(tài)的影響
        5.2.4 Mor處理后對細胞內(nèi)部形態(tài)的影響
        5.2.5 GCRV感染對Caspase 3 酶活性的影響
        5.2.6 Mor作用下對線粒體凋亡通路的影響
    5.3 討論
    5.4 小結(jié)
第六章 Mor對宿主免疫反應(yīng)的調(diào)控作用
    6.1 材料與方法
        6.1.1 Mor處理后對宿主細胞免疫基因表達的檢測
        6.1.2 Mor抗病毒過程中對草魚免疫影響試驗
    6.2 實驗結(jié)果與分析
        6.2.1 Mor處理后對CIK細胞免疫基因表達的影響
        6.2.2 藥物注射處理下對草魚體內(nèi)免疫基因表達的影響
    6.3 討論
    6.4 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]三株不同基因型草魚呼腸孤病毒生物學(xué)特性的差異分析[D]. 殷亮.上海海洋大學(xué) 2014
[2]草魚呼腸孤病毒微載體培養(yǎng)技術(shù)與滅活疫苗浸泡免疫效果研究[D]. 劉秋鳳.上海海洋大學(xué) 2013
[3]草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白VP7核酸疫苗的研究[D]. 徐詩英.南京師范大學(xué) 2012
[4]錦鯉皰疹病毒ORF72和TK基因原核表達及其多克隆抗體的制備與鑒定[D]. 余劍敏.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011



本文編號：2912741