發(fā)布時間：2020-11-19 02:23

　　 萬壽菊(Tagets erecta L.)舌狀花是提取葉黃素(Lutein)的優(yōu)質植物源材料,其花色差異形成機理研究具重要意義。本論文以‘猩紅色’萬壽菊(‘Scarletade’)和‘非洲’萬壽菊(‘Marigold African’)(分別簡稱為‘2013-1’和‘2013-2’)舌狀花為試驗材料,采用高效液相色譜(HPLC)法檢測2個不同花色萬壽菊4個時期(S1期,未開花蕾;S2期,半開花蕾;S3期,開放的頭狀花序;S4期,完全開放的頭狀花序)類胡蘿卜素色素含量變化,Real-time PCR分析其生物合成與降解相關酶基因的表達特性,并利用同源克隆從萬壽菊中獲得類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因CCD1和CCD4b,探討萬壽菊舌狀花類胡蘿卜素代謝關鍵酶基因及花色形成差異的機理,研究結果如下:1萬壽菊舌狀花類胡蘿卜素色素含量分析HPLC技術檢測分析萬壽菊舌狀花4個發(fā)育時期番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、玉米黃素和葉黃素的含量,結果表明:(1)2個品種舌狀花4個不同發(fā)育時期均檢測出葉黃素、玉米黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素4種代謝產物,而番茄紅素僅在‘2013-1’品種中檢出,表明2個品種均含有葉黃素及玉米黃素的2個代謝分支途徑。(2)2個品種中5種類胡蘿卜素含量‘2013-1’均高于或顯著高于‘2013-2’,其中β-胡蘿卜素含量顯著高于其它4種色素。在‘2013-1’品種S3期β-胡蘿卜素含量顯著低于其它3個時期,玉米黃素則最高且顯著高于其它時期;葉黃素S1期顯著低于其它3個時期,推測舌狀花4個時期的外觀顏色變化可能與玉米黃素、葉黃素和β-胡蘿卜素含量變化有關�！�2013-2’品種β-胡蘿卜素含量極顯著高于其它4種色素,且4個時期呈現先高后低的變化趨勢,葉黃素4個時期無顯著差異,α-胡蘿卜素和玉米黃素含量均低,未檢測出番茄紅素。2萬壽菊舌狀花類胡蘿卜素合成相關基因的表達分析采用Real-time PCR分析類胡蘿卜素代謝途徑所有生物合成相關酶基因,結果如下:(1)主通路5個基因表達分析結果顯示,PSY、CRTISO和Z-ISO 3個基因表達量變化趨勢與花色變化基本一致,但淺黃色‘2013-2’品種表達量均較深橙色‘2013-1’品種高;‘2013-1’中ZDS表達量S1期低于或顯著低于其它3個時期,且與番茄紅素含量呈高度正相關,‘2013-2’ZDS表達量在S4期最高并顯著高于其它3個時期,但未檢測出番茄紅素;2個品種PDS-1表達量是PDS-2的10倍,在‘2013-2’PDS-2表達量除S1期外,極顯著高于‘2013-1’,而在‘2013-1’PDS-1高于或極顯著高于‘2013-2’。(2)玉米黃素支路中ZEP和NXS均在S3,S4期表達量較高,且2個品種之間存在顯著或極顯著差異,并與花色變化趨勢基本一致,可能是2個萬壽菊品種花色差異形成的關鍵因素;CHYB變化趨勢2個品種4個時期無明顯規(guī)律但與前人報道結果不同。(3)葉黃素支路中2個品種LCYe 4個時期變化差異不顯著,但與葉黃素含量變化趨勢基本一致,在‘2013-1’中兩者呈極顯著高度相關,推測LCYe可能是葉黃素合成關鍵酶基因;2個品種CYP97A表達水平在S3期最高,并且該基因表達量與葉黃素含量變化呈中度相關或高度正相關,推測CYP97A可能是葉黃素合成關鍵酶基因。3萬壽菊舌狀花類胡蘿卜素降解相關酶基因的表達分析(1)CCD家族利用Real-time PCR方法檢測萬壽菊花蕾轉錄組的7個CCD在2個品種4個不同時期基因表達量。結論如下:‘2013-1’CCD1 S1和S3期表達量最低,S4期極顯著高于其它時期,‘2013-2’CCD1相對表達量整體高于‘2013-1’且S3期存在極顯著差異,‘2013-1’CCD4a相對表達量與花色變化基本一致,但‘2013-2’品種則無明顯關系,2個品種CCD4b表達量S3和S4期均顯著高于前2個時期,CCD7在‘2013-2’4個時期表達量顯著高于‘2013-1’,而NCED2、NCED3和NCED5在‘2013-1’表達量顯著高于‘2013-2’,推測CCD1和CCD4b可能是2個萬壽菊品種花色差異形成的關鍵酶基因。(2)其它降解相關酶基因CCS在‘2013-2’中與β-胡蘿卜素含量變化趨勢基本一致,但在‘2013-1’無明顯相關性,推測其在‘2013-2’中可能與β-胡蘿卜素的生物合成有一定相關性。4 CCD基因克隆分析(1)克隆獲得萬壽菊CCD1基因(Gen Bank登陸號:KX557488)的c DNA全長序列為1 746 bp,編碼區(qū)長度1 623 bp,推測編碼541個氨基酸;蛋白質分析表明Te CCD1為不穩(wěn)定蛋白,不含信號肽,屬RPE65超家族(登錄號:PF03055),包含CCD家族保守結構域,主要定位于細胞質;萬壽菊CCD1核酸序列與除蟲菊CCD1基因同源性最高,為89%;氨基酸序列分析表明萬壽菊CCD1與除蟲菊同源性可高達93%,與其它19個不同種屬CCD1同源性在75%—83%之間,表明是Te CCD1是高度保守的基因;系統(tǒng)進化樹分析顯示Te CCD1的進化基本符合植物分類學的進化規(guī)律,并具有明顯的種屬特征,萬壽菊與菊科同源基因親緣關系最近。(2)利用同源基因克隆獲得CCD4b(Gen Bank登錄號:KY450708),序列分析表明Te CCD4b c DNA全長序列為1 725 bp,編碼區(qū)長度1 392 bp,推測編碼463個氨基酸;編碼的蛋白質Te CCD4b功能主要定位于質體膜,屬RPE65超家族,包含CCD家族保守的結構域;同源分析表明Te CCD4b與向日葵Ha CCD4-L、案頭菊Cm CCD4b同源性最高;系統(tǒng)進化樹分析顯示Te CCD4b與Ha CCD4-L和Cm CCD4b親緣關系最近,與其它不同物種的CCD4和CCD4a存在差異,表明Te CCD4b在進化過程中保守性不強,且進化基本符合植物分類學的進化規(guī)律,不同種屬之間具有明顯差異。
【學位單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S681.9
【部分圖文】：

圖 2-1 2 個萬壽菊品種舌狀花 4 個發(fā)育時期1-4 分別為‘2013-1’舌狀花 S1、S2、S3 和 S4 期5-8 分別為‘2013-2’舌狀花 S1、S2、S3 和 S4 期Fig.2-1 The developmental stages of Ray floret of two marigold varieties1-4：S1、S2、S3 and S4 stage of ray floret in ‘2013-1’;5-8: S1、S2、S3 and S4 stage of ray floretin ‘2013-2’2.1.2.2 標準品溶液的配制玉米黃素和葉黃素標準品用甲醇溶解，α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素標準品用甲基叔丁基醚溶解，番茄紅素標準品用正己烷溶解，除玉米黃素配成濃度為 50μg/mL，其余 4 種均配成 500 μg/mL 儲存液。2.1.2.3 色譜條件向旋蒸干的類胡蘿卜素樣品，加入 1 mL 正己烷，溶解后用有機濾膜（直徑 0.22 μm）過濾，上樣 200 μL，進樣 60 μL；

番茄紅素在本研究中的保留時間為 22.31min、24.11 min、30.82 min、32.20 min和 45.57 min，提取液出峰色譜圖（見圖 2-1、圖 2-2）。圖2-1 類胡蘿卜素標準樣品出峰時間色譜圖Fig.2-1 Chromatograms of carotenoid standard sample of different rentention times22.31min：葉黃素，24.11 min：玉米黃素，30.82 min：α-類胡蘿卜素，32.20 min：β-類胡蘿卜素，45.57 min：番茄紅素22.31min: Lutein, 24.11 min: Zeaxanthin, 30.82 min:α-carotene, 32.20 min: β-carotene

上海交通大學碩士學位論文13圖2-2 萬壽菊類胡蘿卜素提取物液相色譜圖Fig.2-2 Chromatograms of carotenoids extraction of different rentention times22.07 min：葉黃素，24.33 min：玉米黃素，31.22 min：α-類胡蘿卜素，32.12 min：β-類胡蘿卜素，46.07 min：番茄紅素22.07 min: Lutein, 24.33 min:Zeaxanthin, 31.22 min:α-carotene, 32.12 min: β-carotene,46.07 min: Lycopene2.2.2 花發(fā)育過程中類胡蘿卜素色素含量變化圖 2-3、2-4、2-5、2-6 和 2-7 顯示萬壽菊‘2013-1’和‘2013-2’品種舌狀花 4 個不同發(fā)育時期葉黃素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和番茄紅素的含量及變化，2 個品種花發(fā)育過程均檢出葉黃素、玉米黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素4 種代謝產物，番茄紅素在‘2013-1’品種中檢出，表明 2 個品種代謝途徑均含有葉黃素及玉米黃素的 2 個分支途徑。5 種類胡蘿卜素含量‘2013-1’均高于‘2013-2’
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本文編號：2889558