發(fā)布時間：2020-10-18 19:54

　　 葡萄糖耐量因子(GTF)作為酵母富集Cr(Ⅲ)生成的產物,可以增強胰島素的功能,促進糖、脂代謝,逆轉葡萄糖耐受不良,提高糖耐量;保護胰島素β細胞,并且增加胰島素受體數量,提高親和力等功能。由于酵母鉻具有產量大,安全性高等優(yōu)點而備受國內外科學家關注。但是,酵母富集Cr(Ⅲ)的機理卻一直未被闡明。因此,本文以本實驗室保藏的高產GTF酵母菌株YSI-3.7為研究對象,從酵母中鉻的分布、酵母表面基團對酵母富鉻的影響、酵母富鉻過程中基因的表達以及酵母細胞生理過程中氧化應激指標的變化等方面進行了探究。在一定程度上闡明酵母富集Cr(Ⅲ)形成GTF機理,為GTF的工業(yè)化生產提供理論基礎。主要結論如下:1.Cr3+濃度為500μg/m L時,YSI-3.7酵母細胞吸附的總鉻(1803.87μg/g·dcw)和有機鉻(1133.91μg/g·dcw)含量最高。通過EDTA螯合洗脫和酶解洗脫對酵母細胞組分進行分離,印證分析了鉻在不同細胞部位的分布。細胞壁上富集的鉻基本為無機鉻,占菌體富集總鉻的14.43%;原生質體中的鉻占酵母富集總鉻的85.57%,其中73.29%主要為有機鉻。利用EDS能譜掃描及TOF-SIMS對酵母菌體進行橫截面和深度剖析鉻含量的分析表明鉻在酵母細胞中呈均勻分布。2.對酵母細胞表面不同基團(氨基、羧基、磷酸基、酯基)分別進行化學屏蔽,結果表明酵母表面氨基、羧基和磷酸基團對酵母富鉻量有較大影響。紅外光譜分析結果也印證了上述結果。3.利用轉錄組學分析技術對空白酵母和富鉻酵母菌體進行分析,分析RNA-Seq測序結果表明,空白組酵母和500μg/m L Cr3+培養(yǎng)的富鉻酵母中共鑒定出共鑒定5987個基因,其中5796個基因在兩組酵母中均被檢測出來,2333個具有顯著差異表達的基因。其中,有1273個基因表達上調,1060個基因下調。根據KEGG數據庫進行注釋歸類,98條代謝途徑發(fā)生了改變,其中對核糖體代謝、硫代謝、氧化壓力代謝相關、碳代謝,半胱氨酸和蛋氨酸代謝等途徑影響最大。根據GO數據庫注釋歸類,分別為生物途徑(778條途徑)、細胞組分(173條途徑)、分子功能(594條途徑)三類;其中表達差異比較顯著的基因主要有GSH2,SPE4,MET16,CYC1,MSN4等。4.鉻濃度升高導致酵母細胞膜脂過氧化程度加重。在較低濃度(0~500μg/m L)的Cr3+作用下,酵母通過增加總抗氧化能力(T-AOC),還原型谷胱甘肽(GSH)、巰基含量和谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)活力等防御Cr3+的氧化脅迫。而細胞中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(CAT)活力在此過程中變化不明顯。1 mmol/L Na2SO3可增加酵母細胞巰基、GSH、T-AOC含量,從而緩解鉻對于酵母的脅迫作用,提高酵母的生物量和酵母細胞中有機鉻和總鉻的含量。
【學位單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：TQ920.1
【部分圖文】：

科學院碩士畢業(yè)論文 第二章 GTF 高產酵母菌體中鉻（續(xù)養(yǎng)液中 Cr3+濃度μg/mL細胞干重g/100 mL有機鉻μg/g dcw總鉻μg/g·dcw有機鉻/總（%）500 0.97 ±0.05 725.55 ±55.08 1255.53 ±43.75 57.74 ±2800 0.45 ±0.02 536.25 ±36.89 1812.22 ±38.24 29.62 ±2

圖 2.4 不同濃度 Cr3+培養(yǎng)的酵母 YSI-3.7 菌體掃描電鏡圖Fig. 2.4 Scanning electron microscopy(SEM) of YSI-3.7 cultivated atvarious concentrations of Cr3+圖 A 為 0 μg /mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7（對照）；圖 B 為 200 μg/mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7；圖 C 為 500 μg/mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7；圖 D 為 800 μg/mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7。圖 2.4 所示，未加 Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7（圖 A）形狀是規(guī)則的橢圓形，立體形狀飽滿式為芽殖。在 200 μg/mL Cr3+脅迫下，酵母細胞表面沒有顯著變化，胞體上有多個此濃度下，酵母的出芽繁殖活動并沒有受到顯著影響。由酵母表面出現(xiàn)芽痕的數量斷菌齡，而由上圖看出，200 μg/mLCr3+脅迫下具有相同菌齡的 YSI-3.7 相對于空白狀變長。Cr3+濃度增加（500 μg/mL）酵母細胞形狀變得更長，且表面出現(xiàn)了沉淀，酵母細胞壁上富集。同樣，800 μg/mLCr3+濃度時，酵母細胞形變加劇，表面富集更而，圖中各個 Cr3+濃度條件下，YSI-3.7 細胞壁均未受到明顯破壞，都有一個至多說明在上述 Cr3+濃度下，YSI-3.7 可以正常繁殖。生物對有害物質和環(huán)境改變有一定的適應性和抵抗力。環(huán)境中的重金屬在低濃度時，因為這些金屬是微生物細胞中的某些酶的必需成分；但當重金屬含量超過其臨界濃物具有毒性，甚至會殺死微生物（劉鷺，2009；葉錦韶，2002）。從富鉻酵母掃描

圖 2.5 不同濃度 Cr3+培養(yǎng)的酵母菌體透射電鏡圖Fig. 2.5 Transmission electron microscopy(TEM) of YSI-3.7 cultivated atvarious concentrations of Cr3+圖 A 為 0 μg /mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7（對照）；圖 B 為 200 μg/mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7；圖 C 為 500 μg/mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7；圖 D 為 800 μg/mL Cr3+培養(yǎng)的 YSI-3.7。金屬的生理作用或毒害作用必須以進入細胞內為前提。大部分細胞可采用快速吸收類重金屬離子吸收系統(tǒng)（Nies et al., 1999）�？焖傥�收通常僅靠化學滲透離子梯度或消耗降低低能量，緩慢吸收則需要借助 ATP 水解作為能量或化學滲透梯度，需要耗費射電鏡對鉻脅迫下的酵母細胞進行觀察。如圖 2.5 所示，未加 Cr3+處理的 YSI-3.7的橢圓形，并且鋨酸染色比較均勻，細胞核較小，線粒體沿著細胞輪廓均勻地排布；200 μg/mL Cr3+處理的 YSI-3.7 也是呈橢圓形，但是細胞稍微拉長，細胞核變大周圍出現(xiàn)白色空泡。此時，進入酵母的鉻對于酵母內部沒有產生可見的破壞；當 C 500 μg/mL 和 800 μg/mL 時，細胞變成了更細長的無規(guī)則的形狀，并且細胞核中出更大。隨著 Cr3+濃度的升高，YSI-3.7 細胞的形狀變長，細胞壁逐漸變薄，并且內數目越來越多，破壞主要集中在細胞核上，細胞核更容易被高濃度的鉻破壞。推測性（核孔 40～70 nm）比其它生物膜大有關。當環(huán)境中存在低濃度 Cr3+，微生物可3+3+3+
【參考文獻】

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本文編號：2846741