糖尿病心肌損傷與糖尿病患者的高心力衰竭發(fā)生率和高病死率密切相關(guān)，因此，研究建立糖尿病心肌損傷模型對(duì)研究糖尿病心肌病理生理特點(diǎn)及防治藥物的研發(fā)具有十分重要的意義。

　　本研究應(yīng)用高脂飼料和小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射，成功地誘發(fā)了2型糖尿病及心肌病理?yè)p傷模型，并探討了心肌損傷的可能機(jī)制。

　　1 材料與方法

　　1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雄性SD大鼠180～200g，鼠齡為(504-3)d，30只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供；合格證號(hào)：SCXK(京)一2007～0001。大鼠自由飲水、進(jìn)食，室溫(25 4-2) ，分籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1w。飼料：普通大鼠飼料(熱卡百分比為脂肪14％ ，能量359．4千卡／10Qg)和高脂飼料(熱卡百分比為脂肪59％ ，能量475．2千卡／lOOg)：均由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(京)一2005—0007。單籠飼養(yǎng)在恒溫(25℃)的動(dòng)物房中。每天光照12h，自由飲水。

　　1．2 主要試劑鏈脲佐菌素(STZ)(sigma公司)；康博士血糖試紙(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)；總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；AngⅡ、TNF、胰島素試劑盒(北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司)。

　　1．3 主要儀器電子天平(上海第二天平儀器廠)、TGL一16G臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、液氮生物容器YNZ一35—5O(四川亞西機(jī)械廠) 自動(dòng)雙重純水蒸餾器sZ一93(上海容亞生化儀器廠)、光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)(日本Nikon公司產(chǎn)品)、超低溫冰箱(三洋電機(jī)株式會(huì)社)、電熱恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)、超薄切片機(jī)(德國(guó)Leica RM2145)數(shù)碼相機(jī)(日本佳能公司)、血糖儀(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)、Fr630G型微機(jī)多探頭放免儀(北京市核儀器廠)、GL一20G—II型高速冷凍離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)、日立850熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)。

　　1．4 方法

　　1．4．1 動(dòng)物分組及喂食。大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1 w后，將大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組12只與高脂組l8只。對(duì)照組喂飼普通塊料，高脂組喂飼高脂飼料。2組喂食lOw后，禁食6h，高脂組腹腔注射STZ30mg／kg建立大鼠糖尿病模型，STZ臨用前用0．1mol／L的檸檬酸一檸檬酸鈉溶液(pH=4．3)稀釋為1％ 的濃度，避光放在冰板上，快速腹腔注射。同時(shí)正常對(duì)照組腹腔注射檸檬酸一檸檬酸鈉溶液。1w后同法同劑量再一次腹腔注射STZ。末次腹腔注射STZ，1w后用血糖儀測(cè)定空腹血糖和糖耐量，以空腹血糖≥11．1mmol／L，同時(shí)糖耐量的OGTY．曲線下面積大于正常對(duì)照組的160％的2型糖尿病胰島素抵抗大鼠作為對(duì)象，造模成功15只。

　　1．4．2 檢測(cè)指標(biāo)

　　1．4．2．1 空腹血糖。禁食6h，用血糖儀測(cè)尾靜脈血糖。

　　1．4．2．2 糖耐量(OGTY)。大鼠禁食6h，然后稱重，灌胃20％葡萄糖溶液10 mL／kg，分別于0、30、60、120min尾靜脈取血用血糖儀測(cè)定空腹血糖值(FBG)，并計(jì)算OGTY曲線下面積，以評(píng)價(jià)大鼠的胰島素敏感性。

　　1．4．2．3 血液檢測(cè)指標(biāo)。大鼠糖耐量測(cè)定后，水合氯醛麻醉，頸總動(dòng)脈取血，放免法測(cè)定血漿胰島素(INS)，筆耕文化傳播，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)血清膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)。

　　1．4．2．4 心臟檢測(cè)指標(biāo)。取血后處死，并摘取心臟用電子天平稱全心重和左心室重量，并計(jì)算心臟重量指數(shù)(心臟重量與體質(zhì)量相比，HWI，單位msZg)和左室重量指數(shù)(大鼠左心室重量與體質(zhì)量比，LVMI，單位ms／g)。之后立即將左心室放人10％甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，5 p,m厚連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變。各大鼠取右室用生理鹽水制成10％心肌組織勻漿，3 000 r／min離心15 min，吸取上清液迅速放一80~C，備用于測(cè)定下列指標(biāo)：應(yīng)用熒光法測(cè)定心肌組織糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)含量(心肌組織上清在熒光分光光度計(jì)上測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)370nm，發(fā)射波長(zhǎng)440nm，狹縫3 nm。

　　以牛血清白蛋白濃度為1．0 g／L的PBS熒光值為1個(gè)自定義熒光單位(Arbitrary Units of Fluorescence，AUF，樣品熒光強(qiáng)度以此折算)。用放免法按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)心肌組織TNF—IX和AngII。

　　1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用計(jì)算機(jī)SPSS 10．0軟件處理，以(x±s)表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

　　2 結(jié)果

　　2．1 兩組大鼠糖耐量情況從數(shù)據(jù)表及數(shù)據(jù)圖中可見(jiàn)，正常對(duì)照組灌服葡萄糖后2小時(shí)血糖水平基本恢復(fù)正常，高脂組糖耐量各點(diǎn)血糖值均較正常對(duì)照組明顯增高，2小時(shí)血糖水平仍然很高，OG'I3比正常對(duì)照組也明顯增大，符合臨床2型糖尿病胰島素抵抗。說(shuō)明模型組已產(chǎn)生對(duì)胰島素的抵抗，表明模型的建立是成功的。

　　2．2 兩組大鼠血清(漿)FBG、INS、TG和TC水平見(jiàn)表2。表2結(jié)果顯示，2型糖尿病組大鼠血清(漿)FBG、INS、TG和Tc水平較正常對(duì)照組均明顯升高(P<0．01)。

　　2．3 兩組大鼠左室重量指數(shù)及心臟重量指數(shù)的變化與正常對(duì)照組比，糖尿病模型組大鼠左室重量指數(shù)及心臟重量指數(shù)明顯升高(P<0．01)。

　　2．4 兩組大鼠心肌組織TNF一、AngII和AGEs的水平與正常組比較，糖尿病模型組心肌組織TNF一 、AngII和AGEs的含量均明顯升高(P<0．01)。見(jiàn)表4。

　　2．5 兩組大鼠心肌組織光鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察HE染色光鏡下可見(jiàn)正常對(duì)照組大鼠心肌組織無(wú)明顯形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病模型組大鼠心肌細(xì)胞明顯腫脹肥大、變性、核明顯增大，心肌纖維排列和結(jié)構(gòu)紊亂。

　　3 討論糖尿病心肌病變是糖尿病主要并發(fā)癥之一，建立理想的動(dòng)物模型進(jìn)而深入研究其發(fā)病機(jī)制及藥物的治療作用，具有重要的意義和價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射小劑量STZ成功誘導(dǎo)了2型糖尿病心肌病變的大鼠模型 ，表現(xiàn)為高血糖和胰島索抵抗，血液TG、TC、INS明顯升高，而糖耐量明顯降低，類(lèi)似臨床2型糖尿病，表明體內(nèi)存在代謝紊亂。心臟中脂肪酸和脂質(zhì)代謝紊亂在促進(jìn)心功能不全中起重要作用，大量研究顯示，糖尿病心肌損害致心功能不全與血脂增加，尤其是TG的增加有關(guān)。糖尿病時(shí)TG和Tc等脂滴顆粒在心肌細(xì)胞內(nèi)聚積增多，均可形成高脂血癥而損傷心肌細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糖尿病模型組大鼠左室重量指數(shù)和心臟指數(shù)增加，心肌細(xì)胞增大，心肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂，說(shuō)明本試驗(yàn)中糖尿病大鼠心肌病變損傷已形成。