發(fā)布時間：2020-03-26 13:58

【摘要】：黃連素是一種具有廣譜抗菌性的藥物,由于其大量生產(chǎn)和使用,導(dǎo)致大量含有黃連素的廢水排入放到環(huán)境中,對生態(tài)系統(tǒng)造成極大的威脅。針對黃連素廢水生化性差難以生物處理的問題,本研究從黃連素綜合廢水處理系統(tǒng)的活性污泥中分離、篩選并培養(yǎng)出10支對其具有高效降解能力的細(xì)菌菌株,經(jīng)鏡檢、理化性質(zhì)鑒定以及生物學(xué)16S rDNA菌種鑒定確定菌株的身份信息。以黃連素為主要目標(biāo)污染物,分別探究不同菌株對黃連素的降解能力,通過正交試驗,確定并構(gòu)建針對黃連素的高效復(fù)合菌群BDCM,并優(yōu)化降解條件參數(shù),以實現(xiàn)黃連素的高效降解。為深入探索黃連素在BDCM作用下的降解機制和微生物的作用機制,采用了代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合的方式進行協(xié)同研究。本研究得出主要結(jié)論如下:從黃連素廢水處理系統(tǒng)的活性污泥中分離純化得到10支細(xì)菌,經(jīng)鑒定確定其分別為:A1:Citrobacter freundii,A2:Bacillus oleronius,A12:Bacillus endophyticus,B1:Stenotrophomonas maltophilia,B2:Bacillus pumilus,B4:Bacillus cereus,B7:Stenotrophomonas sp.,B16:Sphingopyxis macrogoltabida,B17:Ochrobactrum sp.。當(dāng)黃連素初始濃度在0-20mg·L~(-1)范圍內(nèi),去除效率最高的單菌株是B16。以黃連素為主要目標(biāo)污染物構(gòu)建復(fù)合微生物菌群BDCM,BDCM由菌株A2、A3、B1、B4、B16及B17組成,各菌株間比例為1:1:1:1:1:1。在25℃,pH 7,150 rpm,10%的微生物接種量的最佳條件下,BDCM降解初始濃度為40mg·L~(-1)的黃連素溶液。在48 h內(nèi),黃連素、TOC的去除率分別達(dá)到100%、87%,急性生物毒性從-98%減弱至-2%。黃連素初始濃度在0-80 mg·L~(-1)范圍內(nèi),BDCM對黃連素的降解過程符合零級反應(yīng)動力學(xué)模型,經(jīng)Haldane抑制模型擬合,得出Vmax=40.44 mg(g MLSS·h)~(-1),Km=61.86 mg·L~(-1),Ki=21.23 mg·L~(-1),計算結(jié)果與實驗結(jié)果擬合良好。實時熒光定量PCR監(jiān)測BDCM降解黃連素過程中各菌株的表達(dá)量變化,結(jié)果顯示A2、A3和B4細(xì)菌豐度變化較大,其次是B1和B17,B16在降解過程中細(xì)菌豐度保持平穩(wěn)。菌株B17、A3和B4的豐度在降解反應(yīng)前后呈上升趨勢,推斷在降解過程中,存在黃連素的某些中間代謝產(chǎn)物促進其生長。菌株A2和B1的豐度在反應(yīng)前后略有下降,推斷其對黃連素的中間代謝產(chǎn)物的利用能力不如前者。成功建立了BDCM對黃連素的代謝組學(xué)研究方法。共篩選出288個潛在差異代謝物,檢測其為細(xì)胞內(nèi)溶物質(zhì)、細(xì)胞代謝物及部分黃連素代謝產(chǎn)物。確定了代謝物中的4種為黃連素的中間代謝產(chǎn)物,分別為13,13a-二氫-9,10-二甲氧基-2,3-(亞甲二氧基)-甲基吡啶;3-[苯并1,3二氧雜環(huán)戊烷]-7,8二甲氧基-6,7,8,9四氫-2(3H)-萘酮;2,3-二甲氧基苯甲醛;3,4-二甲氧基苯甲醛,并由此推測出BDCM作用下的黃連素降解途徑。成功建立了BDCM對黃連素的非標(biāo)記蛋白組學(xué)研究方法,解析了蛋白在復(fù)合菌群中降解黃連素的表達(dá)模式及調(diào)控機理。BDCM降解黃連素的蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明:在“1%FDR”過濾標(biāo)準(zhǔn)下,共檢測出6160條肽段和4769個蛋白,明確了黃連素降解過程中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)及其基本信息。蛋白的GO注釋顯示,其中35.88%的蛋白具有調(diào)控基因的分子功能,25%的蛋白參與細(xì)胞組分的構(gòu)成,另外39.12%的蛋白則主導(dǎo)參與生物過程。KEGG通路信息顯示,蛋白參與最多的前三類生物過程分別是抗生素的生物合成、碳代謝和核糖體代謝功能,證明了BDCM可以利用黃連素作為碳源和能源進行正常的生物活動。在FC3.00,T檢驗P-value0.05的標(biāo)準(zhǔn)下共篩選出1352個差異表達(dá)蛋白,其中346個歸屬于BDCM。BDCM中存在上調(diào)差異蛋白135個,下調(diào)差異蛋白211個,其中B1:Stenotrophomonas maltophilia菌屬在代謝過程中發(fā)揮主要的協(xié)調(diào)作用。
【圖文】：

1.1.1 抗生素廢水污染現(xiàn)狀抗生素是微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）代謝產(chǎn)生或人工合成的具抗病原體或其他活性的代謝產(chǎn)物，能在低微濃度下有選擇地抑制或影響細(xì)胞和物體機能 (Manzetti and Ghisi, 2014)。目前，常見的抗生素主要分為四環(huán)素類喹諾酮類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類等。隨著制藥行業(yè)快速發(fā)展，原料藥和藥品制劑生產(chǎn)企業(yè)在不斷增加，生產(chǎn)藥劑的種類及產(chǎn)量均速增長。近年來，抗生素被廣泛地應(yīng)用于人類感染性疾病的控制中，還可作為藥物添加劑等應(yīng)用于畜禽水產(chǎn)的養(yǎng)殖，以及投入農(nóng)業(yè)病害的防治中，在各行業(yè)中都揮了極大的作用。環(huán)境中人用和獸用抗生素的來源和主要污染途徑，，如下圖所示

圖 1-2 黃連素分子結(jié)構(gòu)式Fig.1-2 Molecular formula of berberine黃連素是一種從多種藥用植物中分離出異喹啉季銨鹽，是我國應(yīng)用很久可從黃連、黃柏和三顆針等植物中提取，或者通過化學(xué)方法合成，并作生素應(yīng)用于多種疾病的防治中，具有顯著的抑菌作用 (Wojtyczka)。細(xì)菌臨床上主要應(yīng)用于腸道感染，如胃腸炎。但是隨著科學(xué)深入的研它的功能效果遠(yuǎn)不止這些。根據(jù)我國學(xué)者去年在近幾年發(fā)表的文章，經(jīng)的黃連素可以在多個方面對多種病癥具有不同的作用機制。目前正在研是否可以用于治療心律失常、糖尿病 (Dongetal.,2012)、高脂血癥 (D013)、炎癥 (Wang et al., 2017) 和癌癥。黃連素具有抗心律失常作用。
【學(xué)位授予單位】：中國地質(zhì)大學(xué)(北京)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：X787

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本文編號：2601538