發(fā)布時(shí)間：2020-03-31 11:25

【摘要】：對甲基苯磺酸(PTS)是一種重要的化工合成原料,被廣泛用于醫(yī)藥和農(nóng)藥合成過程。大量研究表明,對甲基苯磺酸具有較強(qiáng)的生物毒性作用,不易生物降解,含對甲基苯磺酸的廢水進(jìn)入環(huán)境后會對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成嚴(yán)重危害。因此,分離對甲基苯磺酸高效降解菌,研究其降解過程和代謝機(jī)制,開發(fā)含PTS廢水生物強(qiáng)化處理技術(shù),具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前,國內(nèi)外關(guān)于PTS微生物降解和代謝機(jī)制的研究較少,尚無將PTS高效降解菌應(yīng)用于廢水生物強(qiáng)化處理工程的報(bào)道。本文篩選到一株能夠高效降解PTS的Hydrogenophaga屬菌株QY7-2,研究了 QY7-2對PTS的代謝途徑、降解基因和降解酶,豐富了 PTS降解微生物種質(zhì)資源庫;將高效菌株QY7-2應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的序批式生物膜反應(yīng)器,研究高效菌株的定殖情況和反應(yīng)器的運(yùn)行工藝參數(shù),并將高效菌株應(yīng)用于含PTS的農(nóng)藥生產(chǎn)廢水實(shí)際處理工程中,進(jìn)行生物強(qiáng)化處理,實(shí)現(xiàn)了廢水中PTS的有效去除,為廢水特征污染物的處理和達(dá)標(biāo)排放提供了技術(shù)支撐。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1、PTS降解菌株的分離和降解特性研究以PTS為唯一碳源,通過連續(xù)傳代富集技術(shù)獲得能夠降解PTS的富集液,從富集液中分離到菌株QY7-2。根據(jù)菌株QY7-2的生理生化和16SrDNA基因同源比對,將菌株鑒定為均Hydrogenophaga s.,與模式菌株Hydrogenophagaatypical BSB 41.8T 同源性最高,同源性為98.34%。菌株QY7-2可以在21h內(nèi)完全降解200mg/LPTS,其最適條件為初始pH值為6.0-7.0,溫度為30℃-35℃.利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對PTS降解過程中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,推測QY7-2降解PTS的代謝途徑為:首先,側(cè)鏈甲基在氧化酶的作用下被氧化,生成對羧基苯磺酸;而后羧基對位上的磺酸基在雙加氧酶的作用下氧化生成3,4-二羥基苯甲酸;最終被礦化生成C02和H20。菌株QY7-2對PTS降解的動力學(xué)研究表明,降解過程符合Monod方程。2、PTS降解關(guān)鍵基因的克隆及表達(dá)利用Illumina Hiseq 2000測序技術(shù)測定了菌株QY7-2的基因組框架圖。菌株QY7-2基因組大小為4911693bp,編碼的ORF有4590個(gè),G+C含量為68.77%。與已報(bào)道的PTS降解相關(guān)基因進(jìn)行比對,在菌株QY7-2體內(nèi)定位到與甲基氧化相關(guān)的疑似基因簇ptsABCD。比對結(jié)果顯示基因ptsA和ptsB編碼的蛋白序列PtsA和PtsB與已經(jīng)報(bào)道的菌株T-2中4-甲基苯磺酸甲基單加氧酶的氧化組分和還原組分分別有99%和97%的同源性,而基因ptsC和ptsD編碼的蛋白序列PtsC和PtsD與菌株T-2中的4-醛基苯磺酸脫氫酶和4-羥甲基苯磺酸脫氫酶均顯示出99%的同源性。通過構(gòu)建pET-28a表達(dá)質(zhì)粒,在E.coli BL21中成功表達(dá)并通過鎳柱純化了 PTS降解的關(guān)鍵酶PtsA、PtsB、PtsC和PtsD。將純化的酶在體外進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)PtsAB可以將對甲基苯磺酸氧化成對羥甲基苯磺酸,比活力為161.5±3.3 nmol min-1 mg-1;PtsD可以將對羥甲基苯磺酸氧化成為對醛基苯磺酸,比活力為429 ± 2.6 nmol min-1 mg-1;PtsC可以將對醛基苯磺酸氧化成為對羧基苯磺酸,比活力為481± 2.9 nmol min-1 mg-1。3、實(shí)驗(yàn)室規(guī)模序批式生物膜反應(yīng)器(SBBR)處理PTS廢水研究以分離到的PTS降解菌株為強(qiáng)化菌劑,利用序批式生物膜反應(yīng)器考察了 PTS降解菌劑強(qiáng)化處理含PTS廢水的有效性。結(jié)果表明,通過投加強(qiáng)化菌劑,可以有效提高廢水中COD和PTS的處理效率。通過熒光定量PCR技術(shù)監(jiān)測了啟動過程中菌株QY7-2在生物膜中上的生長情況。利用Design Expert 8.0.5軟件Box-Behnken方法設(shè)計(jì)了三因素三水平的實(shí)驗(yàn),以COD去除率和PTS去除率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)曲面法對工藝運(yùn)行參數(shù)進(jìn)行了雙目標(biāo)優(yōu)化;分析了運(yùn)行溫度、pH和水力停留時(shí)間(HRT)間的相互關(guān)系和對兩個(gè)響應(yīng)值的影響度;得到了 COD去除率和PTS去除率的二次多元回歸擬合模型,通過模型預(yù)測確定了最優(yōu)反應(yīng)條件為溫度為31.77℃,pH為6.69,HRT為2.49d,最優(yōu)運(yùn)行效果為COD最大去除率為96.04%,PTS最大去除率為91.43%。4、生物強(qiáng)化技術(shù)處理PTS廢水工程化應(yīng)用結(jié)合菌株QY7-2強(qiáng)化處理PTS廢水的前期研究結(jié)果,將分離到的PTS高效降解菌應(yīng)用于江蘇某農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)廢水處理工程中(處理規(guī)模700 m3/d),改善了原有處理設(shè)施的運(yùn)行效果,為同類廢水生物強(qiáng)化處理提供了技術(shù)支持。采用PTS降解菌劑強(qiáng)化前,企業(yè)原有系統(tǒng)對有機(jī)物和PTS的去除率分別為78.32%和7.07%;采用PTS降解菌劑強(qiáng)化后,有機(jī)物和PTS的去除率分別為97.12%和89.24%;出水中有機(jī)物濃度由950mg/L-1050mg/L 下降至 100mg/L-200m/L,出水中 PTS 濃度 50mg/L-80mg/L。同時(shí)利用高通量測序技術(shù),對生物強(qiáng)化系統(tǒng)不同運(yùn)行階段的活性污泥樣品進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增子測序。結(jié)果顯示運(yùn)行穩(wěn)定后污泥樣品中微生物種群豐度和多樣性與啟動時(shí)相比均明顯升高;根據(jù)序列在門水平上的分類可以看出,生物強(qiáng)化體系啟動開始、調(diào)試完成以及穩(wěn)定運(yùn)行一段時(shí)間后的污泥體系微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異,變形菌門(Proteobacteria)相對豐度在不斷增加,其中丙型變形菌門(Gammaproteobacteria)相對豐度始終明顯增加,α型變形菌門(Alphaproteobacteria)在滿負(fù)荷穩(wěn)定運(yùn)行一段時(shí)間后明顯下降;同時(shí)擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度在運(yùn)行過程中也始終呈下降趨勢;根據(jù)序列在屬水平上的分類,噬氫菌屬(Hydrogenophaga)的相對豐度在生物強(qiáng)化系統(tǒng)運(yùn)行過程中相對豐度不斷增加,啟動階段結(jié)束時(shí)Hydrogenophaga進(jìn)水端和出水端的相對豐度已達(dá)到5.241%和6.129%,而到穩(wěn)定運(yùn)行階段的相對豐度已達(dá)到14.338%和9.542%,可見投加的高效降解菌株可以很好的在強(qiáng)化系統(tǒng)中定殖,形成了穩(wěn)定的微生物群落體系,表現(xiàn)出高效穩(wěn)定的生物強(qiáng)化作用。
【圖文】：

Ｔ－ＲＦＬＰ技術(shù)是廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)解析的一種分了？指紋圖譜技術(shù)，，被逡逑公認(rèn)為是進(jìn)行復(fù)雜環(huán)境微生物群落研究的強(qiáng)有力工具之一［８４：８５］，其基本原理及操作流逡逑程如圖１－７所示。逡逑＿邋一邐ｒｎＴｆｍｉＴ逡逑（0）邋Ａ１邐0丨丨】

本文編號：2609013