發(fā)布時間：2020-11-17 21:02

　　 深海鏈霉菌Streptomyces somaliensis SCSIO ZH66分離自我國南海深度為3536米的海底沉積物之中。深海鏈霉菌的所處環(huán)境十分特殊(如：高鹽、高壓、低溫、低光照、低氧和寡營養(yǎng)),在這種極端環(huán)境下它們進(jìn)化形成了獨特的次級代謝途徑,從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類型新穎多樣并具有優(yōu)良活性的次級代謝產(chǎn)物。S.somaliensis SCSIO ZH66的全基因組測序及生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：其基因組大小約為7.1 Mb,由124個連續(xù)克隆群組成,推測共包含6312個開放閱讀框,預(yù)測有16個編碼次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇。本研究采用基因阻斷、基因調(diào)控及異源表達(dá)等策略對深海鏈霉菌S. somaliensis SCSIO ZH66進(jìn)行了基因組采掘研究。主要獲得了以下結(jié)果：第一,對新穎的非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS)生物合成基因簇nrps-3進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,預(yù)測其可能編碼一類糖基化或甲基化的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物；對其中非核糖體肽合酶基因orf7和orf8進(jìn)一步分析,推測編碼產(chǎn)物由6個氨基酸前體形成�；�因雙交換阻斷突變株Δorf8發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC指紋圖譜分析結(jié)果表明,其次級代謝產(chǎn)物相比于野生型菌株有明顯的差異。隨后對突變株Δorf8進(jìn)行了大規(guī)模發(fā)酵,樣品經(jīng)過C18反相開放柱得到了15個組分。多重耐藥菌(multi-drug resistant. MDR)抑制活性實驗結(jié)果表明突變株與野生株所產(chǎn)生的差異峰所在組分Fr. 6具有明顯的MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus)抑制活性。進(jìn)而對Fr.6中的差異峰進(jìn)行了分離純化得到了5個化合物,并通過HRMS和NMR分析確定了它們的結(jié)構(gòu),分別為violapyrones A-C、H和I。其中violapyrone B的MRSA抑制活性為：100μg樣品對MRSA的抑菌圈直徑為25 mm。此研究結(jié)果表明,nrps-3基因簇中orf8基因的阻斷未檢測到nrps-3基因簇的編碼產(chǎn)物,但使突變株積累了violapyrones類化合物。第二,多效調(diào)控基因regP12在S. somaliensis SCSIO ZH66中的異源表達(dá)研究。將來源于另外一株海洋鏈霉菌Streptomyces sp. OUC6819的多效調(diào)控基因regP12置于組成型表達(dá)啟動子gapDHp之下構(gòu)建成表達(dá)載體,然后采用接合轉(zhuǎn)移方法導(dǎo)入S. somaliensis SCSIO ZH66之中,獲得重組菌株ZH66/pMT3::regP12。重組菌株發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果表明,與野生株相比,重組菌株的次級代謝產(chǎn)物發(fā)生了明顯變化,產(chǎn)生了3個新的化合物峰,同時喪失了2個violapyrones類化合物的產(chǎn)生能力。此結(jié)果表明,異源多效調(diào)控基因regP12對S. somaliensis SCSIO ZH66的次級代謝表現(xiàn)出調(diào)控功能,為下一步從中分離新穎結(jié)構(gòu)化合物奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q936
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 海洋放線菌
    1.2 海洋放線菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物
        1.2.1 生物堿
        1.2.2 萜類
        1.2.3 大環(huán)內(nèi)酯類
        1.2.4 環(huán)肽
        1.2.5 醌類
    1.3 海洋放線菌非核糖體肽合成酶生物合成途徑研究進(jìn)展
        1.3.1 非核糖體肽（NRPS）合成酶以及合成途徑
        1.3.2 海洋放線菌NRPS生物合成途徑的研究
    1.4 放線菌基因組以及基因組采掘
        1.4.1 放線菌基因組
        1.4.2 放線菌基因組采掘
        1.4.3 海洋放線菌基因采掘
    1.5 促使放線菌基因簇表達(dá)的方法
        1.5.1 優(yōu)化培養(yǎng)條件
        1.5.2 操作轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因
        1.5.3 基因敲除
        1.5.4 異源表達(dá)
    1.6 本文研究的目的和意義
第二章 材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗菌株
        2.1.2 實驗質(zhì)粒和載體
        2.1.3 實驗引物
        2.1.4 實驗儀器
        2.1.5 實驗試劑
        2.1.6 培養(yǎng)基與抗生素
        2.1.7 實驗所用的抗生素
        2.1.8 緩沖液
    2.2 實驗方法
        2.2.1 菌種保藏
        2.2.2 大腸桿菌質(zhì)粒的快速提取
        2.2.3 堿裂解法質(zhì)粒提取
        2.2.4 酸酚法提質(zhì)粒
        2.2.5 瓊脂糖凝膠電泳
        2.2.6 總DNA提取
        2.2.7 PCR片段酚抽濃縮
        2.2.8 膠回收（試劑盒）
        2.2.9 接合轉(zhuǎn)移
        2.2.10 感受態(tài)的制備、電轉(zhuǎn)
        2.2.11 酶切、鏈接反應(yīng)
        2.2.12 目的基因擴(kuò)增
        2.2.13 基因組文庫的篩選
        2.2.14 菌株活化
        2.2.15 菌體發(fā)酵培養(yǎng)
        2.2.16 發(fā)酵液處理
        2.2.17 發(fā)酵液樣品HPLC條件
        2.2.18 發(fā)酵樣品分離純化條件
        2.2.19 樣品TLC分析
        2.2.20 發(fā)酵浸膏樣品液液萃取
        2.2.21 樣品正相硅膠柱分離純化（干法上樣）
        2.2.22 樣品開放柱柱分離純化（濕法上樣）
        2.2.23 多重耐藥菌抑菌實驗
        2.2.24 序列分析網(wǎng)站
        2.2.25 其他
第三章 深海鏈霉菌S. somaliensis SCSIO ZH66中nrps-3生物合成基因簇的研究
    3.1 引言
    3.2 實驗結(jié)果
        3.2.1 S.somaliensis SCSIO ZH66中nrps-3基因簇的生物信息學(xué)分析
        3.2.2 突變株Δorf8發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析
        3.2.3 突變株Δorf8的大規(guī)模發(fā)酵
        3.2.4 突變株Δorf8發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化
        3.2.5 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定
        3.2.6 化合物violapyrone B的MDR菌抑制活性實驗
    3.3 本章小結(jié)
第四章 多效調(diào)控基因regP12在鏈霉菌S somaliensis SCSIO ZH66中異源表達(dá)研究
    4.2 引言
        4.2.1 Streptomyces sp.OUC6819中regP12基因生物信息學(xué)分析
        4.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.3 重組菌株的構(gòu)建
        4.2.4 重組菌株發(fā)酵樣品HPLC分析
        4.2.5 重組菌株差異峰的初步研究
    4.3 本章小結(jié)
第五章 結(jié)語與展望
    5.1 結(jié)語
    5.2 未來工作展望
參考文獻(xiàn)
致謝
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