發(fā)布時(shí)間：2017-12-13 12:30

  本文關(guān)鍵詞：巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在防御牛分枝桿菌感染和存活中的機(jī)制研究

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【摘要】：牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)不僅能夠感染牛、鹿等哺乳動物,還可以通過空氣和食物感染人,從而引起結(jié)核病。與結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)類似,牛分枝桿菌主要感染巨噬細(xì)胞,通過多種機(jī)制適應(yīng)胞內(nèi)環(huán)境并進(jìn)行繁殖與傳播。而巨噬細(xì)胞則通過凋亡機(jī)制控制細(xì)菌的傳播。除外源性的死亡受體和內(nèi)源性的線粒體損傷這兩條經(jīng)典的凋亡途徑外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激這一條新的凋亡途徑也越來越受到重視。本研究著眼于巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡這一新的機(jī)制,不僅探究了牛分枝桿菌感染引起巨噬細(xì)胞發(fā)生的凋亡是否由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所引起,還研究了牛分枝桿菌感染引起的巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的具體信號通路和分子機(jī)制。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.本研究首先用牛分枝桿菌以MOI 10感染小鼠Raw 264.7巨噬細(xì)胞,檢測了細(xì)胞的凋亡率、Caspase的表達(dá),證實(shí)了牛分枝桿菌感染能夠引起巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡;其次,通過觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)學(xué)變化和檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子的活化,證實(shí)了牛分枝桿菌感染能夠引起巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為了進(jìn)一步研究該細(xì)胞凋亡是否由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起,本試驗(yàn)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性抑制劑4-PBA對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,然后感染牛分枝桿菌。結(jié)果表明,4-PBA抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子和Caspase的表達(dá),從而證實(shí)了牛分枝桿菌誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的一個(gè)原因。另外,本試驗(yàn)通過使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激動劑Tm和抑制劑4-PBA預(yù)處理巨噬細(xì)胞,從正反兩個(gè)方面驗(yàn)證了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡能夠有效地控制巨噬細(xì)胞內(nèi)牛分枝桿菌的數(shù)量。2.為了研究牛分枝桿菌誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的具體信號通路的變化,本試驗(yàn)首先檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜蛋白STING轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)與下游分子TBK1共定位的情況以及不同時(shí)間點(diǎn)TBK1的磷酸化變化。結(jié)果表明,牛分枝桿菌能夠引起STING的轉(zhuǎn)位并迅速與TBK1在胞質(zhì)中組裝聚集,從而激活TBK1。然后,通過4-PBA對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4-PBA抑制了STING與TBK1的共定位以及TBK1的磷酸化水平。為了研究TBK1活化對其下游分子IRF3的作用,本試驗(yàn)利用兩種不同濃度的TBK1特異性抑制劑BX-795預(yù)處理巨噬細(xì)胞,然后感染牛分枝桿菌,在感染后24 h檢測IRF3的磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BX-795顯著抑制了 IRF3的磷酸化水平。另外,通過細(xì)胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)牛分枝桿菌感染后24 h,磷酸化的IRF3進(jìn)入到了細(xì)胞核,該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了牛分枝桿菌能夠引起IRF3的活化。3.本研究探索了 STING-TBK1-IRF3信號通路的活化引起細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。首先,本試驗(yàn)在感染牛分枝桿菌后檢測了線粒體的膜電位以及細(xì)胞色素c和Bax的轉(zhuǎn)位。結(jié)果表明,牛分枝桿菌的感染使線粒體膜電位下降,并能夠引起細(xì)胞色素c從線粒體轉(zhuǎn)移到胞質(zhì),Bax從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體;并通過BX-795對細(xì)胞預(yù)處理,進(jìn)一步證實(shí)了 IRF3的活化能夠引起線粒體發(fā)生損傷。然后,本試驗(yàn)對IRF3和Bax進(jìn)行了免疫共沉淀,結(jié)果表明活化的IRF3與Bax相互作用,共同轉(zhuǎn)移到了線粒體引起線粒體損傷。最后,研究發(fā)現(xiàn)BX-795降低了牛分枝桿菌引起的Caspase-8和Caspase-3的活化,表明活化的IRF3最終通過Caspase-8和Caspase-3引起細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BX-795的預(yù)處理顯著增加了牛分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.618

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Chávez-Galán L;Arenas-Del Angel MC;Zenteno E;Chávez R;Lascurain R;;Cell Death Mechanisms Induced by Cytotoxic Lymphocytes[J];Cellular & Molecular Immunology;2009年01期

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本文編號：1285184