發(fā)布時(shí)間：2017-12-14 08:39

  本文關(guān)鍵詞：中國(guó)野生華東葡萄泛素連接酶基因VpRH2抗白粉病功能研究

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【摘要】：歐洲葡萄(Vitis vinifera L.)是世界上主要的栽培種,但是對(duì)白粉病抗性差;葡萄白粉病是嚴(yán)重影響歐洲葡萄生長(zhǎng)發(fā)育和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的主要因素之一。本研究課題組前期根據(jù)白河-35-1高抗白粉病的特性,接種白粉菌構(gòu)建了cDNA文庫(kù)。本研究以cDNA文庫(kù)中獲得的EST序列(GR883881)為基礎(chǔ),克隆了VpRH2的基因全長(zhǎng)及其啟動(dòng)子序列,篩選獲得了VpRH2的互作蛋白VpGRP2A,進(jìn)行了VpRH2和VpGRP2A的亞細(xì)胞定位分析和互作位置分析,將VpRH2在歐洲葡萄無(wú)核白中過(guò)表達(dá),并進(jìn)行了抗病性分析,主要研究結(jié)果如下:1.通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)獲得VpRH2基因全長(zhǎng),其開(kāi)放閱讀框(Open reading frame,ORF)為1164 bp,編碼387個(gè)氨基酸。經(jīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析,VpRH2含有RING-H2和跨膜結(jié)構(gòu)域,屬于ATL家族,與歐洲葡萄ATL20同源,氨基酸同源性為93.02%,其中154位氨基酸殘基的天冬氨酸為插入突變;在葡萄基因組網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),VpRH2定位在第二條染色體上。2.通過(guò)對(duì)抗病葡萄白河-35-1和感病品種無(wú)核白接種白粉病進(jìn)行定量PCR分析表明,在抗病葡萄中VpRH2表達(dá)量升高,感病葡萄中Vv RH2表達(dá)量降低。亞細(xì)胞定位分析得出VpRH2定位在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì),在ER、TGN/EE和內(nèi)膜組分中也有分布。ABA處理后,VpRH2的表達(dá)表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì),經(jīng)SA和Me JA處理后表現(xiàn)出上調(diào)的趨勢(shì)。3.根據(jù)公布的葡萄基因組序列同源克隆獲得了VpRH2啟動(dòng)子序列,脅迫相關(guān)的順式作用元件ABRE、Box-W1、TC-rich repeats、TCA-element和TGACG-element等存在于啟動(dòng)子的各個(gè)區(qū)域,與歐洲葡萄Vv RH2啟動(dòng)子相比,存在較長(zhǎng)的3段缺失突變和一段插入突變。將VpRH2和Vv RH2的啟動(dòng)子構(gòu)建GUS融合載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)化歐洲葡萄佳利釀葉片,經(jīng)接種白粉菌、噴施Me JA、SA、ABA以及高溫和低溫等不同脅迫處理后進(jìn)行GUS染色和GUS蛋白定量,分析表明:經(jīng)白粉菌、Me JA和SA誘導(dǎo)處理后,VpRH2啟動(dòng)子與Vv RH2啟動(dòng)子啟動(dòng)活性均表現(xiàn)出了增長(zhǎng)的趨勢(shì),而VpRH2啟動(dòng)子受誘導(dǎo)更為顯著;在高溫處理后VpRH2和Vv RH2啟動(dòng)子都表現(xiàn)出了增長(zhǎng)的趨勢(shì),但Vv RH2啟動(dòng)子活性高于VpRH2啟動(dòng)子;兩個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)活性在ABA處理后表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢(shì)而對(duì)低溫脅迫處理不敏感。4.通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)獲得VpRH2的互作蛋白VpGRP2A(Glycine-rich RNA-binding protein 2A),并通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(Bimolecular fluorescencecomplementation,Bi FC)驗(yàn)證得出互作發(fā)生在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。VpRH2和VpGRP2A通過(guò)26S蛋白酶體途徑降解,但是VpGRP2A的蛋白降解沒(méi)有受到VpRH2的明顯促進(jìn)。VpGRP2A能夠促進(jìn)VpRH2的表達(dá),同時(shí)VpGRP2A的表達(dá)受到VpRH2的抑制。5.中國(guó)野生華東葡萄VpGRP2A與歐洲葡萄Vv GRP2A表現(xiàn)出100%的同源性;通過(guò)對(duì)抗病葡萄白河-35-1和感病品種無(wú)核白接種白粉病進(jìn)行定量PCR分析表明,VpGRP2A和Vv GRP2A表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式,均為接種白粉病后6~24 h內(nèi)表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢(shì),而后趨于穩(wěn)定;VpGRP2A具有細(xì)胞核定位,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、TGN/EE和內(nèi)膜組分中也有分布。VpGRP2A在ABA處理后上調(diào)表達(dá),在SA和Me JA處理后表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢(shì)。6.轉(zhuǎn)基因OERH2葡萄表現(xiàn)出對(duì)白粉病增強(qiáng)的抗性,生長(zhǎng)初期表現(xiàn)出加速生長(zhǎng)的表型,同時(shí)在OERH2轉(zhuǎn)基因葡萄海綿組織細(xì)胞內(nèi)部有結(jié)構(gòu)變化,經(jīng)超薄切片觀察確認(rèn)為定位于液泡和液泡膜上高密度物質(zhì)。轉(zhuǎn)基因OERH2擬南芥表現(xiàn)出對(duì)擬南芥白粉菌增強(qiáng)的抗性和外源ABA增強(qiáng)的耐受性。綜上所述,中國(guó)野生華東葡萄泛素連接酶基因VpRH2具有抗葡萄白粉病菌的功能。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S436.631

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