發(fā)布時間：2018-04-01 13:20

  本文選題：柔嫩艾美耳球蟲　切入點：鴉膽子　出處：《浙江大學》2016年博士論文

【摘要】：雞球蟲病是雞常見的寄生蟲病,危害嚴重,每年對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經濟損失。目前該病防治工作的開展主要依靠藥物,但是隨著蟲株耐藥性的產生,部分抗球蟲藥物的效果大大降低甚至完全失效,因此發(fā)現新的藥物刻不容緩。藥用植物鴉膽子具有抗癌、抗阿米巴原蟲、抗巴貝斯蟲和抗瘧疾等多種功效,但其抗球蟲活性仍有待研究。本研究通過人工感染雞球蟲病模型評價鴉膽子提取物的體內治療效果,利用熒光定量PCR技術在體外檢測鴉膽子提取物對球蟲增殖的影響,并運用電子顯微鏡觀察鴉膽子處理對卵囊或子孢子形態(tài)及超微結構的改變,初步探索鴉膽子提取物的抗球蟲作用機制。一、鴉膽子提取物制備及化學成分鑒定為制備實驗所需的鴉膽子提取物,本試驗運用薄層色譜法對藥用植物進行理化鑒定,通過乙醇回流法結合萃取方法制備鴉膽子提取物,并采用氣象色譜-質譜聯(lián)用技術(GC-MS)對其中的提取物鴉膽子油進行了化學成分分析。形態(tài)學觀察及理化鑒定結果表明,實驗材料為苦木科植物Brucea javanica(L.)Merr.成熟干燥的果實。實驗制備了三種鴉膽子提取物,分別為石油醚提取物(Brucea javanica petroleum ether extract,BJ-PE)、乙醇提取物(Brucea javanica ethonal extract,BJ-EE)和水提物(Brucea javanica water extract,BJ-WE),GC-MS 分析結果表明鴉膽子油(即石油醚提取物)主要包含油酸等長鏈的脂肪酸、脂肪醇類化合物以及少量芳香族揮發(fā)性成分。二、鴉膽子醇提物對雞球蟲病的治療作用研究為明確鴉膽子提取物對雞球蟲病的治療作用,實驗一將雞分為5組:鴉膽子酵提物實驗組(2.5g及5g生藥每千克飼料)、常山酮陽性對照組、感染不給藥組和不感染不給藥組,每組10只雞,攻蟲后檢測雞便血、糞便卵囊數量和組織病變程度。結果表明,與對照組相比,實驗組雞只的血便排出量和病變計分顯著降低(P0.05),但體重變化不顯著,且抗球蟲指數最高僅為131,顯示輕度抗球蟲效果。基于上述結果設計實驗二,增設較高劑量的鴉膽子酵提物組(10 g生藥每千克飼料),每組10只雞,檢測指標同上。結果顯示增設的高劑量給藥組抗球蟲指數最高可達146,具有中等強度的抗球蟲效果。在實驗二的基礎上,將實驗三每組雞數量擴大至20只,檢測相關指標。結果進一步顯示,鴉膽子醇提物能有效減少雞血便的產生,降低卵囊排出量和盲腸中第二代裂殖體的數量,減輕盲腸病變程度,且對病雞體重增重無顯著影響;低、中、高劑量下抗球蟲指數分別為154、161和155,達到了中等或良好的抗球蟲效果。綜上,本試驗表明鴉膽子醇提物具有顯著的抗雞球蟲作用,可作為抗雞球蟲病的候選藥物作進一步研究。三、鴉膽子醇提物與鴉膽子素-D體外抗球蟲活性研究為研究鴉膽子醇提物(BJ-EE)和鴉膽子特征性化合物鴉膽子素-D(Bruceine-D)的體外抗球蟲活性,本試驗利用MDBK細胞系建立柔嫩艾美耳球蟲的體外培養(yǎng)體系,采用MTT法測定BJ-EE和Bruceine-D對MDBK細胞的毒性,并基于上述試驗結果明確了體外抗球蟲實驗采用的藥物濃度分別為BJ-EE(2、1、0.5、0.25 和 0.125 μg/ml)、Bruceine-D(0.8、0.4、0.2、0.1 和 0.05 μg/ml),藥物作用時間分別為24 h、48 h和65 h。實驗結果顯示,BJ-EE(2 μg/ml)和Bruceine-D(0.8 μg/ml)作用于細胞65h時,細胞存活率在90%以上;與對照組相比,BJ-EE實驗組中球蟲DNA增殖量顯著降低,Bruceine-D除48 h、0.05 μg/ml實驗組均表現出了顯著差異,即具有抑制球蟲增殖的作用;且球蟲DNA增殖量在48 h和65 h時呈現藥物劑量依賴性,即藥物濃度越高則球蟲的增殖量越低。綜上所述,BJ-EE和Bruceine-D在體外具有良好的抗球蟲活性。四、鴉膽子提取物抗雞球蟲病作用機制初步探索為明確鴉膽子提取物治療雞球蟲病的作用機制,本研究使用不同濃度的石油醚提取物(BJ-PE)、乙醇提取物(BJ-EE)、水提物(BJ-WE)和Bruceine-D孵育處理未孢子化卵囊,并利用光學顯微鏡和透射電鏡觀察作用后球蟲子孢子形態(tài)和超微結構的改變。觀察可見乙醇提取物、水提取物和Bruceine-D均表現出抑制卵囊孢子化的作用;乙醇提取物和Bruceine-D處理后的子孢子呈現皺縮、變圓、變短、細胞輪廓模糊、細胞膜破裂的現象,且胞內細胞器排列混亂,細胞結構扭曲,呈現病態(tài)的啞鈴型。該結果表明鴉膽子對球蟲卵囊孢子化具有輕微抑制作用,并在子孢子階段具有比較顯著的殺傷作用。因此,鴉膽子提取物抗球蟲作用可能集中于子孢子階段。綜上所述,本實驗制備了鴉膽子石油醚提取物(油)、乙醇提取物和水提物,其中鴉膽子油主要含有油酸等脂肪酸類或脂肪醇類化合物;鴉膽子提取物具有抗雞球蟲病的作用,抗球蟲效果可達中等或良好;鴉膽子醇提物和Bruceine-D對體外培養(yǎng)球蟲的DNA增殖有抑制作用;提取物對球蟲子孢子階段具有明顯殺傷作用,但具體作用機理還需深入研究。該研究為抗球蟲藥物的研發(fā)提供了新的方向。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31

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本文編號：1695763