發(fā)布時間：2018-01-12 19:01

  本文關鍵詞：BCL2L10抑制肝細胞癌生長與轉移的體內外實驗研究　出處：《河北醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：肝細胞癌(HEpatocellular carcinoma,HCC)是世界上五大常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率居全球第6位,位列腫瘤相關死亡原因的第3位。其起病隱匿,往往進展至晚期階段才被發(fā)現(xiàn)。HCC發(fā)生發(fā)展的生物學機制仍不清楚,目前手術切除是治療HCC唯一有效方法,但切除術后的高轉移率和高復發(fā)率嚴重影響其預后。因此對HCC的發(fā)病機制研究一直是全球研究的熱點,其過程是多因素多階段多基因變異共同作用的病理過程。研究表明,細胞凋亡和增殖貫穿于其發(fā)生發(fā)展的全過程,涉及多種抑制細胞凋亡的基因高度表達、異常激活及誘導細胞凋亡的抗癌基因異常失活。目前認為,細胞凋亡抑制在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。BCL2L10(Bcl2-like-10)是在分離新型BCL-2同源基因時被發(fā)現(xiàn)的由204個氨基酸組成的多肽,蛋白質分子量23kDa。BCL2L10屬于BCL-2家族成員,廣泛表達于人類組織中。BCL-2家族是進化上保守的細胞凋亡的關鍵性調節(jié)者,其通過促凋亡或抗凋亡在正常胚胎發(fā)育、組織內穩(wěn)態(tài)和多種病理狀態(tài)下發(fā)揮不可替代的作用。根據(jù)對細胞凋亡的影響B(tài)CL-2家族分為兩類:抗凋亡家族成員和促凋亡家族成員,前者抗凋亡的作用受后者的拮抗。作為BCL-2家族中最晚被鑒定出來的成員,BCL2L10 mRNA在正常人骨髓、肝臟、腦、肺組織中表達量較高。最初認為BCL2L10與BCL-2一樣同屬于抗凋亡家族成員。有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、結腸腺癌和非小細胞肺癌中BCL2L10腫瘤特異性表達上調。然而最近有研究報道,與非癌胃粘膜組織相比BCL2L10在胃癌組織中表達下調,過表達BCL2L10可促進胃癌細胞凋亡、抑制其增殖,發(fā)現(xiàn)BCL2L10作為腫瘤抑制因子在胃癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用�；�礎研究指出,BCL2L10這種在不同癌組織中發(fā)揮截然相反作用的能力,可能是由于其可根據(jù)不同的組織環(huán)境和細胞類型發(fā)揮出不同的作用有關。盡管有研究發(fā)現(xiàn)BCL2L10在正常人肝組織表達相對較高,但目前尚缺乏其在HCC中表達與作用的研究。為了闡明BCL2L10在HCC中的作用,本文中我們首先比較了BCL2L10在人HCC及其癌旁組織中的表達以及其在不同HCC細胞系及人正常肝細胞的表達;其次通過與腫瘤增殖、凋亡、轉移相關的體內外功能實驗,發(fā)掘BCL2L10在HCC中的功能作用;最后應用人類癌癥通路芯片及驗證實驗探索BCL2L10在HCC作用的分子機制。第一部分BCL2L10在肝細胞癌組織及細胞中的表達目的:分析對比BCL2L10在人HCC組織及其癌旁組織中的表達以及其在不同HCC細胞系及人正常肝細胞的表達。方法:收集河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院肝膽外科2014-5至2015-6行外科手術治療的HCC患者的HCC組織及其癌旁組織42對。應用realtimepcr檢測42對HCC患者HCC組織及癌旁組織中BCL2L10的表達;BCL2L10mrna在HCC組織較其癌旁組織表達降低的30對標本中應用westernblot分析檢測BCL2L10蛋白的表達水平;應用HE和免疫組化染色觀察BCL2L10在HCC及其癌旁組織中的表達;應用反轉錄pcr(rt-pcr)及realtimepcr分別檢測BCL2L10mrna在HepG2、HEp3b、huh6、Huh7和smmc7721共5種HCC細胞系、正常人肝細胞lo2及1對HCC組織及配對癌旁組織中的表達;應用westernblot方法檢測BCL2L10蛋白在HepG2、Huh7、smmc7721共3種HCC細胞系、正常人肝細胞lo2、1對HCC組織及其配對的癌旁組織中的表達。結果:1在42對患者標本中有30個HCC組織BCL2L10mrna表達水平明顯低于其配對的癌旁組織(30/42);在這30對標本中HCC組織的BCL2L10蛋白表達水平明顯低于其配對的癌旁組織。2免疫組化染色顯示BCL2L10在癌旁組織中高表達呈棕黃色,主要表達于細胞漿,而在HCC組織中呈現(xiàn)低表達。3BCL2L10mrna在癌旁組織及l(fā)o2細胞中表達較高,而在HepG2、HEp3b、huh6、Huh7、smmc7721HCC細胞中表達較低,其中在HepG2、HEp3b、huh6、Huh7細胞中表達降低較明顯;BCL2L10蛋白在癌旁組織及l(fā)o2細胞中表達較高,而在HepG2、Huh7、smmc7721細胞中表達較低,其中在HepG2、Huh7細胞中表達降低較明顯。結論:BCL2L10在HCC組織及細胞中表達較癌旁組織及正常肝細胞降低。第二部分BCL2L10對肝細胞癌增殖、凋亡作用的體內外實驗研究目的:通過在體外HCC細胞中過表達或敲低BCL2L10,探討B(tài)CL2L10對HCC增殖及凋亡的影響,在體內裸鼠成瘤試驗中進一步驗證其對HCC生長的作用。方法:在人HCC細胞系HepG2和Huh7中過表達BCL2L10,在人HCC細胞系smmc7721中敲低BCL2L10;通過cck-8試驗檢測細胞活力,克隆形成實驗觀察細胞增殖情況,流式細胞術檢測細胞周期變化,westernblot檢測增殖標志物pcna以及細胞周期蛋白cdc25c的表達,觀察BCL2L10對HCC增殖的影響;通過annexinv/pi雙染染色檢測細胞凋亡比例,westernblot檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、8、9(caspase-3、caspase-8、caspase-9)表達,評估BCL2L10對HCC凋亡的影響;裸鼠成瘤實驗觀察BCL2L10過表達HepG2細胞對裸鼠皮下移植瘤生長的影響。結果:1在HepG2和Huh7細胞系中成功過表達BCL2L10,在smmc7721中成功敲低BCL2L10。應用帶flag標簽的BCL2L10過表達質粒(gv141-BCL2L10)分別轉染HepG2和Huh7細胞,并以僅帶flag標簽的空載體(gv141-control)作為對照,rt-pcr和westernblot結果顯示,兩種細胞BCL2L10組BCL2L10mrna和蛋白表達水平較control組均明顯上升,表明該質粒在兩種細胞中均成功過表達BCL2L10。應用靶向BCL2L10的sirna(si-BCL2L10)轉染smmc7721細胞,并轉染無關對照序列(si-control)作為對照,rt-pcr和westernblot結果顯示,與si-control組比較,si-BCL2L10組BCL2L10mrna和蛋白表達水平明顯下降,表明BCL2L10在smmc7721細胞中的表達被顯著抑制。2BCL2L10抑制HCC細胞增殖BCL2L10抑制HCC細胞生長活力。cck-8試驗結果顯示,轉染過表達BCL2L10質粒72h后,HepG2和Huh7兩種細胞系中,BCL2L10組細胞生存率較control組明顯降低。敲低BCL2L10后72hsmmc7721細胞中,敲低組smmc7721/si-BCL2L10細胞生存率較對照組smmc7721/si-control明顯增高。表明BCL2L10抑制HCC細胞生長活力。BCL2L10抑制HCC細胞克隆形成�？寺⌒纬山Y果顯示:HepG2/control組細胞克隆數(shù)為588.0±51.05,而轉染BCL2L10的HepG2/BCL2L10組細胞克隆數(shù)為230.7±35.96,明顯低于陰性對照組,且形成的克隆較小。Huh7/control組細胞克隆數(shù)為386.3±24.52,而轉染BCL2L10的Huh7/BCL2L10組細胞克隆數(shù)為153.0±29.57,明顯低于陰性對照組,且形成的克隆較小。表明過表達BCL2L10后的HCC細胞克隆形成能力降低。BCL2L10降低HCC細胞中pcna表達。westernblot分析結果顯示,過表達BCL2L10的HepG2和Huh7細胞中,BCL2L10組pcna相對表達水平明顯低于control組。表明BCL2L10可抑制HCC細胞增殖。BCL2L10阻滯了細胞周期。流式細胞術結果顯示,HepG2細胞在轉染BCL2L10過表達質粒48h后,與對照組相比,過表達組g2/m期細胞所占比例上升,s期細胞所占比例減少,g1期細胞比例無明顯變化;Huh7細胞在轉染BCL2L10過表達質粒48h后,與對照組相比,過表達組g2/m期細胞所占比例上升,s期細胞所占比例減少,g1期細胞比例無明顯變化。表明過表達BCL2L10可將HepG2及Huh7細胞周期阻滯在g2/m期,從而抑制細胞有絲分裂,抑制細胞增殖。BCL2L10可降低細胞分裂周期蛋白cdc25c的表達。westernblot分析結果顯示,過表達BCL2L10的HepG2和Huh7兩種細胞中,BCL2L10組細胞分裂周期蛋白cdc25c相對表達水平明顯低于control組。表明BCL2L10可能通過抑制促分裂周期蛋白cdc25c的表達抑制細胞增殖。3BCL2L10促進HCC細胞凋亡成功將BCL2L10在HepG2和Huh7細胞上過表達、在smmc7721細胞上敲低的基礎上,應用流式細胞儀annexinv/pi雙染染色檢測細胞凋亡比例,結果顯示在HepG2和Huh7細胞過表達BCL2L10組細胞凋亡比例較對照組明顯升高,在smmc7721細胞中敲低BCL2L10組細胞凋亡比例較對照組明顯降低;應用westernblot檢測活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、8、9(caspase-3、caspase-8、caspase-9)結果顯示,HepG2和Huh7細胞中過表達BCL2L10組caspase-3、caspase-8及caspase-9的表達均較對照組增加。4BCL2L10抑制HepG2細胞裸鼠皮下移植瘤生長裸鼠成瘤實驗結果顯示:BCL2L10過表達組裸鼠皮下移植瘤體積明顯小于對照組。結論:BCL2L10抑制HCC增殖,促進其凋亡,抑制HCC生長。第三部分BCL2L10對肝細胞癌遷移、侵襲、血管生成作用的體內外實驗研究目的:應用體內體外實驗評價BCL2L10在HCC遷移、侵襲、血管生成中的作用,探討B(tài)CL2L10在HCC轉移中的作用。方法:在成功過表達以及敲低BCL2L10的基礎上,應用創(chuàng)傷愈合實驗評估細胞遷移行為;應用martrigel侵襲實驗評估其對HepG2細胞侵襲的影響;應用人臍靜脈內皮細胞血管形成實驗觀察BCL2L10對HCC細胞血管形成作用的影響;對裸鼠皮下移植瘤組織行HE染色和cd34免疫組化染色,觀察BCL2L10對體內移植瘤血管形成的影響;應用裸鼠HCC肺轉移模型觀察BCL2L10在HCC轉移中的作用。結果:1BCL2L10抑制了HCC細胞遷移在HepG2、Huh7兩種過表達BCL2L10細胞系中,BCL2L10組較control組劃痕愈合明顯減慢。在smmc7721細胞中敲低BCL2L10后si-BCL2L10組較si-control組劃痕愈合速度加快。2BCL2L10明顯抑制了HepG2細胞的侵襲能力。3BCL2L10抑制HCC血管生成血管形成體外實驗:過表達BCL2L10組HepG2細胞的條件培養(yǎng)基較對照組明顯減少了血管內皮細胞的血管形成能力,提示BCL2L10可抑制HCC的血管生成能力。血管形成體內實驗:HE染色觀察BCL2L10過表達組HepG2細胞在裸鼠體內形成的皮下移植瘤血管數(shù)量少于對照組;cd34免疫組化染色分析顯示BCL2L10過表達組HepG2細胞形成的皮下移植瘤組織cd34陽性面積明顯小于對照組;提示BCL2L10抑制體內HCC組織的血管生成能力。4BCL2L10抑制裸鼠HCC肺轉移HE染色發(fā)現(xiàn)空載體HepG2細胞注射組裸鼠肺轉移發(fā)生率為83.3%(5/6),而BCL2L10過表達HepG2細胞注射組裸鼠肺轉移發(fā)生率為33.3%(2/6),提示BCL2L10可抑制裸鼠體內HCC肺轉移。結論:BCL2L10抑制HCC遷移、侵襲、血管生成,抑制HCC肺轉移。第四部分BCL2L10抑制肝細胞癌生長與轉移的分子機制目的:探討B(tài)CL2L10抑制HCC的分子機制。方法:應用BCL2L10過表達質粒轉染HepG2細胞后采用人類癌癥通路pcr芯片分析其基因表達譜;應用Western blot在蛋白水平驗證相關基因的表達變化;結合全部四部分研究結果描繪出BCL2L10抑制HCC具體分子通路示意圖。結果:1與空載體組相比,BCL2L10過表達組細胞的相關基因表達有明顯變化,這些基因涉及到與腫瘤形成密切相關的細胞生長、凋亡、粘附、轉移、血管生成幾方面。其中,過表達BCL2L10后與對照組相比表達明顯增加的基因有:與細胞凋亡相關的tnf(2.5倍)、tnfrsf25(1.8倍)和tnfrsf10b(1.5倍),與細胞粘附相關的cdh11(4.8倍)、cdh1(1.5倍),與轉移抑制相關的基因timp2(20.9倍)、timp1(1.7倍);過表達BCL2L10后與對照組相比表達明顯降低的基因有:與細胞遷移相關的mmp9(-8.0倍)、mmp13(-13.1倍),與血管生成相關的vegfc(-3.3倍)。過表達BCL2L10后在所有檢測到有變化基因中,jak1表達變化最大,其表達較對照組下降了23倍。2Western blot結果顯示:過表達BCL2L10上調了CDH11、CDH1蛋白的表達,分別下調了MMP9、VEGFC、p-LAK1 and p-STAT3蛋白的表達。3以上研究結果提示:BCL2L10可通過調節(jié)細胞周期、增殖、凋亡、轉移、血管生成抑制HCC的生長與轉移,在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮其腫瘤抑制作用。結論:1過表達BCL2L10可通過上調TNF、DR3、DR5、caspase-3、caspase-8、caspase-9、CDH1、CDH11、TIMP1、TIMP2表達,下調PCNA、CDC25C、MMP9、MMP13、VEGFC表達,實現(xiàn)其抑制HCC生長與轉移的作用。2 BCL2L10在HCC中可能通過抑制JAK1-STAT3通路激活發(fā)揮抗腫瘤作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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1 ;Caspase Family Proteases and Apoptosis[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2005年11期

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本文編號：1415553