發(fā)布時間：2018-05-04 14:51

  本文選題：Britanin + 靶標發(fā)現(xiàn)��； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：1、研究目的人體活性氧水平的不斷增加,會打破氧化還原平衡狀態(tài),引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病、組織器官損傷和自身免疫病等一系列疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。在腦缺血再灌注過程中,腦組織內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平會大量升高,進而引起腦組織損傷。因此,通過提高機體抗氧化水平降低機體氧化應(yīng)激壓力,成為腦卒中治療的一條重要途徑。Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)信號通路是機體抵抗氧化壓力的最重要途徑之一。通過激活Nrf2信號通路,可以增強機體抵抗氧化損傷的能力。因此,激活Nrf2信號通路成為針對多種退行性疾病和慢性疾病的治療途徑。靶向Nrf2信號通路是開發(fā)針對神經(jīng)退行性疾病和慢性疾病治療藥物的新研究方向。天然產(chǎn)物來源豐富,藥理藥效開發(fā)潛能具大�；仡櫿麄�藥物研究的歷史,天然產(chǎn)物一直在其中發(fā)揮著舉足輕重的作用,貢獻了諸多療效明確、不可或缺的藥物。天然產(chǎn)物Britanin是一個倍半萜內(nèi)酯類化合物,廣泛分布于菊科旋覆花屬植物中。本課題通過構(gòu)建體外神經(jīng)細胞損傷模型,研究Britanin的神經(jīng)保護作用。為了闡明Britanin發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制,我們開展了Britanin對氧化應(yīng)激和Nrf2信號通路的調(diào)控作用的研究。期望能夠發(fā)現(xiàn)Britanin調(diào)控Nrf2通路的分子靶標。最終,通過構(gòu)建實驗性大鼠腦缺血再灌注損傷(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,評價Britanin在體內(nèi)水平發(fā)揮神經(jīng)保護作用的能力。綜合上述系列研究,為把Britanin開發(fā)成新穎的氧化應(yīng)激相關(guān)疾病治療藥物奠定臨床前研究基礎(chǔ)。2、研究方法(1)體外神經(jīng)細胞損傷模型的構(gòu)建。參考目前神經(jīng)保護方面的研究進展,構(gòu)建了兩種體外神經(jīng)細胞損傷模型。分別是高濃度谷氨酸誘導(dǎo)PC12細胞損傷模型;氧和葡糖糖剝奪再補充(oxygen glucose deprivation followed by reperfusion,OGD-R)誘導(dǎo)原代皮層神經(jīng)元損傷模型。在這兩種細胞模型基礎(chǔ)上,研究天然產(chǎn)物Britanin的神經(jīng)保護作用。(2)研究Britanin對Nrf2信號通路的調(diào)控作用。天然產(chǎn)物Britanin可以保護神經(jīng)細胞,降低氧化應(yīng)激引起的細胞損傷。本研究在原代神經(jīng)元細胞水平上,采用ARE(antioxidant response element)報告基因?qū)嶒�、siRNA干擾實驗、實時熒光定量PCR(Polymerase Chain Reaction)檢測實驗和蛋白免疫印跡實驗等方法,探究Britanin對Nrf2抗氧化信號通路的調(diào)控作用。(3)驗證Britanin與靶標蛋白Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)的共價結(jié)合作用。Keap1蛋白是Nrf2蛋白的負性調(diào)控蛋白,通過結(jié)合Nrf2蛋白引起其泛素化修飾和程序性降解。本研究采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng),表達并純化人源Keap1全長蛋白及其BTB結(jié)構(gòu)域。本課題組前期研究中,設(shè)計合成了生物素化修飾的Britanin小分子探針。在體外機制研究實驗中,本研究采用小分子探針Pull-down靶標蛋白Keap1的方法,初步確證二者之間的相互作用。為了進一步確證Britanin與靶標蛋白Keap1之間的結(jié)合位點,本研究采用LC-MS(liquid chromatograph-mass spectrometer)分析方法,研究Britanin對Keap1蛋白序列中半胱氨酸的修飾作用,確定共價結(jié)合位點。為了明確Britanin與Keap1蛋白BTB結(jié)構(gòu)域的結(jié)合模式,本研究開展了Britanin與靶標蛋白Keap1的復(fù)合物共結(jié)晶實驗。為了闡明Britanin激活Nrf2信號通路的分子機制,我們研究了Britanin對Nrf2蛋白泛素化水平的調(diào)控作用及調(diào)控機制。(4)體內(nèi)構(gòu)建大鼠MCAO模型。與體外研究采用的OGD-R誘導(dǎo)原代皮層神經(jīng)元損傷模型相對應(yīng),我們構(gòu)建了大鼠體內(nèi)MCAO模型,考察Britanin在動物體內(nèi)發(fā)揮抗氧化和神經(jīng)保護作用的能力。3、研究結(jié)果通過體外神經(jīng)細胞保護實驗,我們發(fā)現(xiàn)Britanin可以顯著的保護神經(jīng)細胞,降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞損傷。在這一過程中Britanin可以顯著下調(diào)神經(jīng)細胞受到損傷刺激時的ROS水平。Nrf2信號通路是機體抵抗氧化壓力,維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的最重要調(diào)節(jié)通路。通過報告基因?qū)嶒灪突�因干擾實驗,我們發(fā)現(xiàn)Britanin可以顯著激活Nrf2信號通路,提高Nrf2信號通路下游抗氧化酶的表達水平,進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。Keap1蛋白是Nrf2信號通路的負性調(diào)節(jié)蛋白,可能是Britanin的作用靶標。應(yīng)用小分子探針Pull-down實驗,我們確證了Britanin與靶標蛋白Keap1之間的相互作用。通過LC-MS聯(lián)用實驗,進一步找到了Britanin與Keap1之間的共價結(jié)合位點。通過復(fù)合物共結(jié)晶實驗,我們得到了Britanin與Keap1蛋白BTB結(jié)構(gòu)域的共結(jié)晶結(jié)構(gòu),確證Britanin通過邁克爾加成反應(yīng)共價結(jié)合于Keap1的151位半胱氨酸的結(jié)合模式。通過進一步的分子機制研究,我們發(fā)現(xiàn)Britanin通過靶向Keap1蛋白,干擾了Keap1與Cul3之間的相互作用,使Cul3不能進一步介導(dǎo)對Nrf2蛋白的泛素化修飾和蛋白酶體降解,進而激活Nrf2信號通路。應(yīng)用大鼠急性腦缺血再灌注損傷模型,我們考察了Britanin在體內(nèi)提高機體抵抗氧化應(yīng)激,發(fā)揮神經(jīng)保護作用的能力。Britanin灌胃給藥可以激活Nrf2通路,顯著降低腦組織梗死體積,改善行為學(xué)評分。4、研究結(jié)論本課題發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物Britanin通過靶向Keap1蛋白,激活Nrf2信號通路。Britanin是一個全新的Nrf2信號通路激動劑。通過共結(jié)晶結(jié)構(gòu)解析,揭示了Britanin與Keap1蛋白的結(jié)合模式,闡明了Britanin激活Nrf2信號通路的分子機制。通過體外神經(jīng)細胞保護模型和體內(nèi)大鼠腦缺血再灌注損傷模型,我們發(fā)現(xiàn)Britanin通過激活Nrf2信號通路,可以顯著提高機體抗氧化水平,進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。在后續(xù)研究中,通過對Britanin進行結(jié)構(gòu)改造和篩選Britanin的結(jié)構(gòu)類似物,有希望發(fā)現(xiàn)活性更優(yōu)、選擇性更好的先導(dǎo)化合物,開發(fā)成為氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的全新治療藥物。
[Abstract]:1,鐮旂┒鐩�鐨勪恨Z綋媧繪，

本文編號：1843387