發(fā)布時間：2016-12-23 15:10

  本文關鍵詞：動態(tài)灌注與靜態(tài)保存對犬離體肺保護作用的對比研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《昆明醫(yī)科大學》 2015年

動態(tài)灌注與靜態(tài)保存對犬離體肺保護作用的對比研究

孫相華  

【摘要】：背景肺移植是治療晚期肺實質(zhì)及肺血管疾病的唯一有效方法,近幾年的發(fā)展異常迅速,無論是單、雙肺移植還是心肺移植,均已獲得臨床成功,并且越來越受到人們的關注。成功的肺移植必然要解決供肺保存的質(zhì)量問題,保存方法的優(yōu)劣和保存時間的長短對肺組織的結(jié)構(gòu)和功能有重要的影響。目前臨床上公認的離體肺保存時間最好在4小時以內(nèi),保存方法為肺循環(huán)灌注后的單存低溫保存。離體肺在保存過程中是具有活力的組織,肺組織的能量代謝仍然在進行,但其能量代謝物質(zhì)來源卻中斷了,雖然常用肺保存方法中都有肺灌注,但僅僅局限于肺保存早期,離體肺灌注完成后,僅限于低溫保存,限制了離體肺獲取代謝能量,不利于較長時間的肺保存。離體肺灌注技術長期以來都是臨床和實驗研究的重點,國內(nèi)外許多學者對逆向灌注、預處理、后期再灌注、支氣管動脈再通技術進行了大量研究。目前關于離體肺損傷的研究都沒有取得突破性進展,缺乏一種簡便高效的保護策略,肺保存面臨的問題和局限性日益突出。目的本研究通過比較動態(tài)灌注(體外循環(huán)機持續(xù)灌注與間斷壓力灌注)和靜態(tài)保存(低溫保存)對離體肺保護作用,探討離體肺損傷的機制,闡明模擬肺循環(huán)和心臟機械灌注的優(yōu)越性。方法1.將30只Mongrel犬隨機分成3組,在保持機械通氣的條件下,完整摘取雙肺。進行體外循環(huán)機持續(xù)灌注、間斷壓力灌注、單存灌注離體肺循環(huán)后低溫浸泡保存,并按時間點留取并保存標本。2.采用HE染色法觀察犬離體肺組織病理改變,免疫組化法和蛋白質(zhì)印跡法檢測犬離體肺組織AQP1的表達。3.采用酶消化法分離并培養(yǎng)犬肺微血管內(nèi)皮細胞,顯微鏡觀察肺微血管內(nèi)皮細胞的形態(tài),免疫熒光染色鑒定肺微血管內(nèi)皮細胞。4.將培養(yǎng)的犬肺微血管內(nèi)皮細胞隨機分成三組,分別為模擬體外循環(huán)組、模擬壓力灌注組和模擬低溫保存組,n=10。利用CCK-8法檢測犬肺微血管內(nèi)皮細胞活性、Transwell法檢測犬肺微血管內(nèi)皮細胞遷移能力、Rhodamine 123染色檢測犬肺微血管內(nèi)皮細胞線粒體膜電位、硝酸還原酶法定量測定各組細胞保存液NO的濃度、ELISA法定量測定各組細胞保存液ET-1的濃度以及Western blot測定各組細胞VEGF的表達量。結(jié)果1.HE染色發(fā)現(xiàn),隨著離體時間的延長,肺泡組織結(jié)構(gòu)逐漸塌陷,炎性細胞及滲出增多,肺泡間隔也逐漸增寬,肺泡腔內(nèi)可見滲出物。三組之間比較,體外循環(huán)組的肺組織結(jié)構(gòu)損傷變化較輕,壓力灌注組次之,低溫保存組最嚴重。免疫組化檢測AQP1結(jié)果：各實驗組內(nèi)0h-2h AQP1變化無差異,p0.05,2h-8h AQP1的表達量呈下降趨勢,變化顯著,p0.05；在lh-2h每個時間點上,各組間AQP1變化無差異,p0.05,3h-8h每個時間點上,各組間AQP1變化差異顯著,體外循環(huán)組AQP1蛋白的表達量高于壓力灌注組,壓力灌注組又高于低溫保存組,p0.05。Western blot檢測AQP1結(jié)果：在各實驗組內(nèi),0h-3h AQP1變化無差異,p0.05; 3h-8h AQP1的表達量呈下降趨勢,變化顯著,p0.05；在lh-3h每個時間點上,各組間AQP1變化無差異,p0.05；在4h-8h每個時間點上,各組間AQP1變化差異顯著,體外循環(huán)組AQP1蛋白的表達量高于壓力灌注組,壓力灌注組又高于低溫保存組,p0.05。2.酶消化法分離并培養(yǎng)犬肺微血管內(nèi)皮細胞,此方法成功率高,費用適中,重復性較好。①各組內(nèi),0h-3h肺微血管內(nèi)皮細胞活性變化不顯著,p0.05；3h-8h肺微血管內(nèi)皮細胞活性隨著時間的延長呈逐漸降低,p0.05。在0h-3h的每個時間點上,各組間肺微血管內(nèi)皮細胞活性變化不顯著,p0.05；但在4h-8h的每個時間點上,低溫保存組細胞活性低于壓力灌注組,而壓力灌注組低于體外循環(huán)組,p0.05。②各組內(nèi),0h-5h進入到微孔膜下層的細胞數(shù)目差異不顯著,p0.05；5h-8h細胞數(shù)目顯著減少,p0.05；在0h-4h每個時間點上,各組間肺微血管內(nèi)皮細胞進入到微孔膜下層的細胞數(shù)目變化不顯著,p0.05；但在5h-8h每個時間點上,各組細胞數(shù)目變化顯著,其中體外循環(huán)組肺微血管內(nèi)皮細胞數(shù)目在每個時間點上均高于壓力灌注組,而壓力灌注均高于低溫保存組,p0.05。③在各組內(nèi),肺微血管內(nèi)皮細胞線粒體膜電位總體趨勢是逐漸下降的(0h-3h、p0.05,3h-8h、p0.05);在各組間,在0h-3h每個時間點上,肺微血管內(nèi)皮細胞線粒體膜電位無顯著變化,p0.05,在4h-8h每個時間點,肺微血管內(nèi)皮細胞線粒體膜電位呈現(xiàn)下降趨勢,體外循環(huán)組高于壓力灌注組,而壓力灌注組又高于低溫保存組,p0.05。④犬肺微血管內(nèi)皮細胞保存液NO的濃度在保存起始階段呈逐漸升高的趨勢,但模擬體外循環(huán)組在6小時達到高峰,而模擬壓力灌注組和低溫保存組在4-5小時就已達到峰值,之后各組均呈下降趨勢；在0h-3h,每個時間點保存液中NO的濃度進行組間比較(p0.05)未見明顯差異,在4h-8h,體外循環(huán)組高于壓力灌注組,而壓力灌注組又高于低溫保存組,差異顯著(p0.05)。⑤犬肺微血管內(nèi)皮細胞保存液ET-1的濃度呈逐漸升高的趨勢,但模擬體外循環(huán)組升高的幅度小于模擬壓力灌注組和低溫保存組。在0h-3h,每個時間點保存液中ET-1的濃度進行組間比較(p0.05)未見明顯差異,在4h-8h,體外循環(huán)組低于壓力灌注組,而壓力灌注組又低于低溫保存組,差異顯著(p0.05)。⑥在每種保存方式下,VEGF在離體肺組織中的表達隨著時間的延長呈逐漸上調(diào)的趨勢,0h-3h差異不顯著,p0.05,在3h-8h,差異顯著,p0.05。在lh-3h各個時間點下,各組間肺微血管內(nèi)皮細胞中VEGF基因的表達量無顯著差異,p0.05；而在4h-8h各個時間點下,各組間肺微血管內(nèi)皮細胞中VEGF基因的表達量差異顯著,低溫保存組VEGF基因的表達量顯著高于壓力灌注組,壓力灌注組又顯著高于體外循環(huán)組,p0.05。結(jié)論動態(tài)灌注對離體肺的保護作用顯著優(yōu)于靜態(tài)保存,其中體外循環(huán)機持續(xù)灌注對離體肺的保護作用又優(yōu)于間斷壓力灌注。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R655.3
【目錄】：

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本文編號：224852