發(fā)布時間：2020-11-21 07:58

　　 背景與目的 中國正快速步入老齡化社會,目前中國60歲以上老年人有約1.69億。預計2050年中國60歲以上老年人將占三成,老齡化帶來的種種困擾和問題更加嚴重。衰老和死亡是任何物種的個體都難以避免的最終結局,但至今我們對衰老發(fā)生機制的理解還相當有限。鑒于其重要性,衰老一直是生物學研究的熱點。 經過多年的研究,現在關于衰老的機制已經提出多種學說,每種學說都有其優(yōu)勢和不足。諸如自由基學說、遺傳程序學說、差錯災難學說、交聯學說、脂褐素累積學說、內分泌功能減退學說等,分別從不同的角度探討了衰老發(fā)生的機制和對策。近50年的理論和實驗證實,自由基學說是最有說服力的衰老學說之一。 給動物連續(xù)注射D-半乳糖后,因其代謝產物半乳糖醇不能進一步代謝而堆積在細胞內,導致細胞腫脹,致使動物組織細胞出現衰老的退行性變以及功能的改變。同時D-半乳糖在體內產生的大量自由基超過機體的清除能力,引發(fā)脂質過氧化的鏈式反應,產生大量的脂質過氧化物丙二醛,加重對細胞的損傷。D-半乳糖致衰老動物模型的造模方法簡便易行,價格低廉,結果穩(wěn)定,目前已成為國內公認的衰老動物模型。因此本實驗采取D-半乳糖制備亞急性衰老模型。 骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于胚胎發(fā)育早期中胚層的一類多能干細胞,是全身結締組織的干細胞。大量實驗證實MSCs在合適的體外分化條件下,不僅可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、內皮細胞、肌肉細胞等間質細胞,而且可以跨胚層分化為外胚層的神經元、神經膠質細胞和內胚層的肝細胞。并且MSCs具有移植后不發(fā)生排斥反應的特點。隨著對MSC的深入研究,目前認為MSCs除了具有多向分化潛能,還能在損傷局部反應性分泌多種神經營養(yǎng)因子。這些因子能夠促進局部血管增生、組織再生等,從而起到了治療損傷的作用。 近年來隨著對衰老的深入研究,目前認為衰老是一種與基因相關的疾病,已經發(fā)現某些基因與細胞衰老密切相關。它們可概括為細胞周期調控基因、端粒酶調控基因、生長抑制蛋白基因、DNA/蛋白質合成與修復基因等。衰老還與 一些轉錄因子(反式作用因子)的基因表達或活性改變有關。其中具有細胞增殖調控功能的衰老有關基因有抑癌基因p21、抑癌基因p16、抑癌基因p53、細胞周期素D1 (cyclin D1)、周期素依賴性激酶2 (cycli-n-dependent kinase 2,CDK2)、視網膜神經母細胞瘤蛋白(Rb)、增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)、轉錄因子(A-P-1 E2F)等。這些基因之間相互聯系,可能構成細胞衰老的基因調控鏈。所以本課題將初步探討MSC是否會影響p16、p21及PCNA的表達,這可能是間充質干細胞發(fā)揮抗衰老作用的機制之一 綜上所述,我們擬在研究間充質干細胞逆轉衰老的作用,并且從衰老相關基因來探討MSCs抗衰老的機制。本研究將為間充質干細胞發(fā)揮抗衰老提供理論與實踐基礎。如能取得預期效果,經過良好設計的基礎研究后,其臨床前景廣闊。 實驗方法 第一部分大鼠骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)與鑒定 用貼壁培養(yǎng)法分離、純化大鼠骨髓間充質干細胞,為MSCs的生物治療奠定基礎。無菌條件下取大鼠股骨和脛骨,收集細胞懸液。離心后加入含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基,接種于培養(yǎng)瓶中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待貼壁細胞生長達80-90%融合時傳代。取生長良好的P3代MSCs進行檢測： ①觀察MSCs形態(tài)并做蘇木精-伊紅染色。 ②MTT法和克隆形成實驗測定生長曲線和克隆形成能力； ③流式細胞儀檢測MSCs細胞表面抗原標記和細胞增殖周期； ④在地塞米松、左旋VitC、β-磷酸甘油等作用下向成骨細胞誘導分化；在地塞米松、重組人胰島素的作用下向脂肪細胞誘導分化。 第二部分制備衰老模型,研究間充質干細胞在衰老大鼠體內的遷移。 ①衰老模型的制備選用清潔級SD大鼠,每日皮下注射D-半乳糖400mg/kg,連續(xù)注射4個月,制作衰老模型。取大鼠血清,測定各組大鼠血清中SOD活性和MDA含量。 ②分別從青年對照組和衰老模型大鼠的骨髓中培養(yǎng)出間充質干細胞(MSCs)。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況,流式細胞術(FCM)檢測表面抗原,比較兩組原代細胞集落形成數量和增殖情況,透射電鏡觀察其形態(tài)和結構變化。 ③體外培養(yǎng)純化大鼠骨髓間充質干細胞至第三代,用表達綠色熒光蛋白(GFP)的病毒載體轉染MSCs細胞,在顯微鏡下觀察未轉染MSCs和轉染MSCs的形態(tài)并在熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況,檢測MSCs-GFP的細胞活性和細胞周期,通過流式細胞儀檢測GFP對細胞表面標志(CD29, CD34, CD44, CD45)表達的影響。 ④調整GFP標記間充質干細胞濃度為3×107/mL,將3×106個MSCs通過尾靜脈回輸給衰老大鼠,應用熒光顯微鏡檢測MSCs的遷移。 第三部分間充質干細胞逆轉衰老的效果 SD大鼠30只,隨機均分為3組：對照組、衰老模型組和MSCs治療組。衰老模型組大鼠每日皮下注射D-半乳糖400mg/kg,連續(xù)4個月。MSCs治療組在衰老模型制備成功后,給予尾靜脈輸注3×106個MSCs。 ①實驗結束后,取大鼠血清,測定各組大鼠血清中SOD和MDA；全自動分析儀及酶標儀檢測雌二醇(E2)、孕酮(P)、促黃體生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、睪酮(T)；以及血鈣(Ca)、堿性磷酸酶(ALP)。 ②取各組大鼠胸腺、脾臟、卵巢和睪丸,HE染色后,觀察各組織結構的差異。 ③稱重法測定大鼠胸腺指數和脾臟指數；用MTT法測定脾臟淋巴細胞增殖活性；ELISA法測定胸腺IL-7.IL-10和IL-2含量,以及脾臟IL-10和IL-2的含量；流式細胞儀檢測胸腺中CD4+CD8+T細胞；透射電鏡檢測胸腺組織結構。 ④骨密度掃描儀測量各組大鼠骨密度(BMD)；利用掃描電鏡對大鼠股骨遠端松質骨的形態(tài)結構進行觀察。 第四部分MSCS治療衰老的機制研究 實驗結束時,處死各組大鼠,無菌條件下提取各個組織,應用Real-time PCR檢測各組織中P16、P21和PCNA mRNA的表達。應用免疫印記法檢測各組織中P16、P2、PCNA蛋白的表達。 統(tǒng)計學方法 試驗資料結果用均數±標準差(x±S)表示,顯著性標準為0.05,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA)；組間兩兩顯著性比較方差齊采用LSD法,方差不齊用Dunnett's T3和Dunnett's C法；分析各因素的主效應和交互效應用析因方差分析；重復測量數據用重復測量方差分析；兩個獨立樣本的總體均數比較用獨立樣本t檢驗。 結果 第一部分大鼠骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)與鑒定 利用貼壁篩選的方法分離大鼠骨髓MSCs,經傳代后細胞形態(tài)呈梭形,均勻一致。將P3代細胞低密度接種到培養(yǎng)板,培養(yǎng)1周后可形成散在分布的克隆。細胞生長曲線分析結果顯示接種后第三天細胞進入指數增長期,至第五天進入平臺期。MSCs細胞周期檢測結果顯示G0+G1期的細胞約占80%以上。流式細胞儀檢測顯示P3代細胞均一地表達細胞表面抗原CD44、CD29,不表達CD34和CD45。經定向誘導分化后,細胞分別呈現成骨細胞、脂肪細胞的表型特征。 第二部分制備衰老模型,研究間充質干細胞在衰老大鼠體內的遷移。 ①成功制備了D-半乳糖致亞急性衰老大鼠模型。與對照組相比,衰老模型組SOD的活性明顯降低,MDA含量明顯降低升高,差異有顯著性意義(P0.01)。 ②青年組和衰老模型組的原代和第3代骨髓間充質干細胞在形態(tài)上無差異；流式細胞儀檢測顯示,兩組MSCs的免疫表型一致；兩組細胞也都具有成骨誘導和成脂誘導能力。但與青年對照組相比,衰老模型組MSCs生長速度明顯減慢,集落形成單位明顯降低(P0.05)。透射電鏡觀察發(fā)現,衰老模型組MSCs呈現衰老的形態(tài)和結構變化。 ③GFP轉染后24 h即可見綠色熒光蛋白表達,72 h表達最強,此后逐漸減弱,到4周時仍可見少量表達。并且GFP對MSCs細胞的增殖、細胞形態(tài)、周期及表面抗原的表達均無影響。 ④綠色熒光蛋白標記MSCs回輸到衰老大鼠體內,MSCs能夠歸巢到衰老大鼠的胸腺、脾臟、卵巢、睪丸。MSCs歸巢到衰老大鼠體內第7天時,歸巢的組織仍有熒光存在。 第三部分間充質干細胞逆轉衰老的效果 ①與衰老模型組相比,MSCs治療組SOD的活性明顯升高,MDA含量明顯降低,差異有顯著性意義(P0.05)。酶標儀檢測雌性大鼠血清中激素的水平,結果顯示,MSCs治療組與模型組相比,能夠升高大鼠體內P、E2及睪酮的含量；能夠降低LH、FSH的含量(P0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。各組大鼠的血清鈣、堿性磷酸酶含量測定結果：與正常對照組比較,衰老模型組血清鈣和ALP有所升高(P0.05)；而MSCs治療組與致衰老模型組相比,血清鈣、ALP則明顯降低(P0.05)。 ②MSCs治療組與模型組相比,能使胸腺、脾臟、睪丸和卵巢的結構得到明顯改善：于100倍光鏡下檢測睪丸中不同萎縮程度曲細精管的百分比。結果顯示,治療組與模型組相比,能夠提高正常生精管的比例,減少部分萎縮管及完全萎縮管的比例(P0.05)。與模型組相比,治療組的卵巢中黃體和卵泡數目增多(P0.05),組間比較,差異具有統(tǒng)計學意義。 ③間充質干細胞可增強衰老模型大鼠的免疫功能,顯著提高衰老大鼠的胸腺指數和脾臟指數,增強T淋巴細胞活性,同時增加IL-2和IL-7的表達水平；降低IL-10的表達水平。衰老模型組CD4+CD8+T細胞的百分數明顯低于對照組；治療組與模型組比較,其百分數明顯升高,差異具有顯著性(P0.01)。胸腺組織的透射電鏡分析結果：MSCs治療組與模型組相比,能使胸腺組織結構得到明顯改善。 ④骨密度掃描儀測量骨密度(BMD):MSCs治療組與致衰老模型組相比,全身BMD有所升高(P0.05),股骨BMD明顯升高(P0.05)。掃描電鏡結果顯示：與對照組相比,模型組大鼠的骨小梁變細,斷裂,數量減少,微損傷增多；而治療組與模型組大鼠相比,骨小梁數量增加,骨吸收面減少,膠原纖維排列規(guī)律、整齊。 第四部分MSCS逆轉衰老的機制研究 Real-time PCR檢測各組織中P16、P21和PCNA mRNA的表達結果顯示：與模型組相比,治療組中大鼠各組織內P16和P21 mRNA的表達降低,而PCNA mRNA的表達升高(P0.05)。Western blot結果顯示：治療組P16及P21蛋白表達低于模型組；而PCNA蛋白表達明顯高于模型組。 結論 1.本實驗建立了一種體外穩(wěn)定培養(yǎng)擴增大鼠MSCs的方法,培養(yǎng)的細胞成分單一,通過觀察細胞生物學特性、流式細胞儀測定細胞表面抗原結果符合MSCs標準。適用于對BMSCs進一步的應用研究。 2.衰老模型組的間充質干細胞的數目和功能都發(fā)生了改變,推測隨著大鼠衰老,MSCs細胞可能也會隨著衰老。因此移植青年大鼠MSCs對移植治療會有更好的效果。 3.GFP熒光穩(wěn)定持久,對轉染細胞的生物學特征無明顯影響,并且其熒光表達時間達4周,因此可以將其作為間充質干細胞的示蹤標記。經尾靜脈移植的MSCs能夠較長時間定位于衰老大鼠的各器官。 4.本實驗從功能水平、生化水平及細胞水平檢測,發(fā)現間充質干細胞能夠修復衰老所致大鼠組織的損傷,具有治療大鼠衰老的作用。 5.MSCs可明顯下調p16和P21,上調PCNA的表達,可能是其逆轉衰老的機制之一。 本研究的創(chuàng)新點 1.對免疫系統(tǒng)、骨質疏松的作用：間充質干細胞可增強老年大鼠免疫功能；MSCs細胞可以修復D-半乳糖所致骨質疏松癥。 2.衰老模型大鼠MSCs的生長速度和增殖能力發(fā)生了改變,因此移植青年大鼠MSCs作為種子細胞,對移植治療會有更好的效果。 3.通過Real-time PCR和免疫印跡方法,發(fā)現MSCs可明顯下調p16和P21,上調PCNA的表達,這些基因之間可能相互聯系,構成細胞衰老的基因調控鏈。MSCs可能通過抑制p16和P21的表達,促進細胞周期從G1期向S期進展；另一方面,MSCs可能通過抑制P21,進而釋放PCNA蛋白,推進DNA合成、增殖。最終逆轉組織細胞衰老。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

圖l一5P3代MSCS(xl00)Fig.l一5Passage3ofMSCs(xl0o)圖A:P3代MSCs細胞形態(tài)均一，呈長梭性，不再以集落方式生長而呈均勻的紡錘形生長分布;圖B:P3代MSCS細胞的HE染色。

圖l一5P3代MSCS(xl00)Fig.l一5Passage3ofMSCs(xl0o)圖A:P3代MSCs細胞形態(tài)均一，呈長梭性，不再以集落方式生長而呈均勻的紡錘形生長分布;圖B:P3代MSCS細胞的HE染色。

將P3代細胞低密度接種到培養(yǎng)板，培養(yǎng)1周后可形成散在分布的克隆。第14天的CFU一F為(22.6士2.4)(圖l一8，1一9)。圖1一8.Mscs形成的細胞克隆(科0)圖1一9.Mscs細胞克隆的吉姆薩染色(x40)Fig.1一 8TheelonesofMSCs(X40)Fig.l一 9TheclonewasmeasuredbyGiemsa， 5staining(X40) 4.5MSCs細胞的鑒定利用FCM檢測培養(yǎng)的P3代骨髓間充質干細胞表面標記物，實驗結果發(fā)現，CD29陽性細胞達到99.9%;CD44陽性細胞數達到97.8%;CD34和CD45陰性細胞數分別為993%、99.1(圖1一10)。
【參考文獻】

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本文編號：2892768