發(fā)布時間：2020-10-30 20:38

　　 大氣污染是影響公眾健康的首要環(huán)境危險因素之一。大氣污染物是由諸多污染物組成的復(fù)雜混合物,目前公認的各種大氣污染物中,可吸入顆粒物(particulate matter, PM)與人群健康效應(yīng)各終點的流行病學(xué)聯(lián)系最為密切,是定量評價大氣污染健康危害的標志性污染物。顆粒物,特別是空氣動力學(xué)直徑≤10μm的可吸入顆粒物(PM10)是國內(nèi)外許多大城市的首要污染物。大量流行病學(xué)調(diào)查研究表明,可吸入顆粒物與人類呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率、死亡率密切相關(guān),能引起哮喘、肺功能下降、呼吸系統(tǒng)炎癥,甚至累及心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、促進癌癥發(fā)生。對歐洲29個國家的調(diào)查研究表明,PM10每升高10μg／m3,呼吸系統(tǒng)疾病的病死率提高0.58%。德國科學(xué)家于1985-1994年對4757名婦女進行了調(diào)查研究,結(jié)果顯示慢性暴露于PM10以及居住在主干道路附近的婦女肺功能受到了有害的影響,慢性阻塞性肺炎的發(fā)病率上升。在我國,對于中國現(xiàn)有的顆粒物暴露和死亡率關(guān)系的劑量-反應(yīng)關(guān)系資料的Meta分析表明,PM10每增加10μg／m3,急性死亡率增加0.38%。對于太原市空氣顆粒物與呼吸系統(tǒng)疾病每日住院率相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn),PM10每增加10μg／m3,呼吸系統(tǒng)疾病每日住院率上升0.72%-2.15%。據(jù)統(tǒng)計,地球上每年P(guān)M10的生成量約幾十億噸,一個成年人一晝夜會吸入約數(shù)萬個甚至數(shù)十萬個大氣顆粒物。因此,大氣污染顆粒物對人群健康的影響已成為世界各地環(huán)境、氣象和醫(yī)務(wù)工作者極為關(guān)注的前沿性課題。 支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種以嗜酸性粒細胞為主的眾多炎癥細胞和炎癥因子參與的慢性氣道炎癥性疾病。近年來,其患病率及死亡率均呈逐年上升趨勢。在一些發(fā)達國家,例如美國的兒童哮喘患病率從1980年的3.6%上升到2003年的5.8%；而我國兒童哮喘患病率也從1990年的2.03%上升到2000年的4.63%。專家警告：到2025年,如果全球人口的城市化比例從現(xiàn)有的45%升至59%,哮喘病患者將有可能達到4億人,每250例死亡病例中就有1例由哮喘病導(dǎo)致。哮喘已經(jīng)成為僅次于癌癥的世界第二大致死和致殘疾病,而中國已經(jīng)成為全球哮喘死亡率最高的國家之一。既往流行病學(xué)調(diào)查研究表明,大氣中可吸入顆粒物濃度升高與哮喘患者數(shù)量增加密切相關(guān)；在亞洲沙塵暴發(fā)生的時段中,臺灣和韓國地區(qū)哮喘病的日就診率明顯增加；同時實驗研究發(fā)現(xiàn)暴露于來源于美國洛杉磯高速公路附近的PM10能夠?qū)е侣训鞍?ovalbumin, OVA)誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)增強。因此,研究大氣污染顆粒物對哮喘小鼠的損傷作用機制對加強顆粒物污染防治及敏感人群的健康保護具有重要的現(xiàn)實意義和指導(dǎo)意義。 呼吸道是可吸入顆粒物的靶器官,肺巨噬細胞是呼吸道內(nèi)部重要的防御屏障。在它吞噬顆粒物進行消化過程中,加速各種炎性因子的合成與釋放,擾亂了細胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡,從而啟動了炎癥過程,促進炎癥發(fā)展,對肺部造成損傷。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是近年來備受關(guān)注的一種病原體識別受體,主要表達于巨噬細胞和樹突狀細胞表面。TLRs是跨膜蛋白,通過辨認識別生物體內(nèi)保守的病原相關(guān)分子模式(pathogens associated molecular patterns, PAMPs),活化巨噬細胞和樹突狀細胞,產(chǎn)生細胞因子和趨化性細胞因子,啟動天然免疫應(yīng)答,構(gòu)成機體免疫反應(yīng)的第一道防線[21]。PAMPs是廣泛存在于病原體細胞表面的分子標志,如酵母細胞壁上的甘露糖,以及脂多糖、肽糖、胞壁酸等各種細菌的細胞壁成分。巨噬細胞可以通過其細胞表面表達的TLRs來識別和結(jié)合PAMPs,從而激發(fā)細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo),而引起機體天然免疫反應(yīng)。同時TLRs與PAMP的結(jié)合還可以刺激抗原遞呈細胞產(chǎn)生致炎細胞因子激發(fā)被動免疫。然而,其他的模式識別受體如Nod樣受體(Nod-like receptors, NLRs)也參與天然免疫的介導(dǎo)[25]。NLRs家族的成員NALP3 (NACHT-, LRR-and pyrin-domain containing protein 3)是細胞質(zhì)受體,被微生物配體肽聚糖和細胞損傷的內(nèi)源性標記物(如ATP和尿酸結(jié)晶等)激活。具有活性的NALP3與銜接蛋白如凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing caspase recruitment domain, ASC)結(jié)合而形成NALP3炎癥復(fù)合體。該復(fù)合體激活半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1),進而分泌白細胞介素-1β(Interleukin 1β, IL-1β),促進炎癥反應(yīng)。本研究中應(yīng)用大氣污染顆粒物對小鼠巨噬細胞進行染毒,通過檢測細胞中TLRs和NALP3炎癥復(fù)合體的基因表達而探討大氣污染顆粒物對哮喘小鼠損傷作用的機制。 在本研究中使用電子加熱器將采集于我國北京空氣中的城市空氣顆粒物(urban particulate matte, UPM)和采集于日本壹歧島空氣中的亞洲沙塵暴浮塵顆粒物(air-borne Asian sand dust, AASD)的部分樣本進行加熱處理,以去除吸附于其表面的微生物、SO42-和NO3-等成分。本實驗中應(yīng)用OVA致敏小鼠,采用氣管灌注的方法,分別將加熱處理的UPM (heated UPM, H-UPM)、未加熱處理的UPM、加熱處理的AASD (heated AASD, H-AASD)和未加熱處理的AASD的懸浮液注入小鼠體內(nèi),觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化,支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中炎癥細胞的分布變化,BALF中細胞因子和趨化性細胞因子的蛋白表達改變,以及血清中OVA特異性IgE和IgG1抗體的表達變化。體外培養(yǎng)小鼠巨噬細胞系(RAW264.7)觀察TLRs和NALP3炎癥復(fù)合體的基因表達變化,從而探求北京城市空氣顆粒物和亞洲沙塵暴浮塵對機體健康危害的機制。本研究是關(guān)于北京城市空氣顆粒物和亞洲沙塵暴浮塵對于OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠氣道炎癥作用的首次實驗研究。 實驗方法 1、樣本處理 分別將采集到的UPM和AASD樣本在電子加熱器中經(jīng)過360℃加熱處理30min,以除去吸附于顆粒物表面的微生物、SO42-和NO3-等成分。 2、真菌檢測 應(yīng)用熒光顯微鏡和真菌菌相Y熒光染料檢測UPM和AASD樣本中的真菌。參照真菌菌相Y熒光染料的實驗說明書,將2.5μg的樣本懸浮于40μl熒光染料中,經(jīng)過5 min后制作成玻璃切片,于熒光顯微鏡下觀察。激發(fā)波長為472.5 nm,發(fā)射波長為520.0 nm。 3、水溶性成份、脂多糖及β-葡聚糖的檢測 應(yīng)用離子色譜和電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜分析UPM和AASD樣本中的水溶性成份如SO42-和NO3-等。應(yīng)用Endospec ES test MK檢測UPM和AASD樣本中的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)含量,應(yīng)用Fungitec G test MK檢測UPM和AASD樣本中的β-葡聚糖含量。 4、實驗動物及染毒 從Charles River公司(神奈川,日本)購入雄性ICR小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始實驗。每間隔一周,將小鼠在4%三氟溴氯乙烷作用下麻醉,經(jīng)氣管注入顆粒物(0.1 ml/mouse)和／或OVA (0.1 ml/mouse)。最后一次染毒的第二天,經(jīng)小鼠腹腔注射戊巴比妥,將其深度麻醉,放血處死。 5、實驗動物的病理檢測 剖取小鼠肺部固定于10%中性福爾馬林緩沖液中,肺葉分離后,將其切割成2 mm大小的碎塊,用石蠟包埋,制作成3μm厚的切片。HE染色后觀察呼吸道由近端向遠端嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤情況。PAS染色后觀察支氣管上皮杯狀細胞的增殖情況。應(yīng)用顯微鏡對每個切片的炎癥細胞和上皮細胞進行觀察分析。 6、采集支氣管肺泡灌洗液和血液 小鼠深度麻醉,心臟采血,離心后取上清液,-80℃C的深度冰箱中保存,用于檢測血清中的OVA特異性抗體IgE和IgGl的表達；氣管固定,用無菌生理鹽水灌洗小鼠肺部,收集灌洗液后離心取上清液,-80℃的深度冰箱中保存,用于檢測BALF中細胞因子和趨化性細胞因子的蛋白表達。 7、支氣管肺泡灌洗液中的細胞計數(shù) 將支氣管肺泡灌洗液離心后得到的沉淀溶于生理鹽水中,制成細胞懸液,顯微鏡下應(yīng)用血細胞計數(shù)器直接計數(shù)總細胞數(shù)。細胞懸液應(yīng)用細胞離心涂片機,應(yīng)用Diff-Quik染色,顯微鏡下觀察計數(shù)嗜酸性粒細胞等炎性細胞。 8、肺泡灌洗液中的細胞因子和趨化性細胞因子的檢測 應(yīng)用酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測BALF中細胞因子和趨化性細胞因子的蛋白表達。其中細胞因子包括：白細胞介素(Interleukin, IL)-4、IL-5、IL-12、IL-13和干擾素(interferon, IFN)-γ;趨化性細胞因子包括：角質(zhì)細胞趨化因子(Keratinocyte chemoattractant, KC)、巨噬細胞炎癥蛋白(macrophage inflammatory protein, MIP)-1α單核細胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein, MCP)-1、MCP-3、調(diào)節(jié)激活正常T細胞表達和分泌細胞因子(regulated on activation normal T cell expressed and presumably secreted, RANTES)和嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin)。 9、OVA特異性IgE和IgG1抗體的檢測 應(yīng)用鼠OVA-IgE ELISA試劑盒和鼠OVA-IgG1 ELISA試劑盒檢測血清中的OVA特異性IgE和IgGl抗體。 10、細胞培養(yǎng)及染毒 本研究中采用由BALB/c雄性小鼠中提取的巨噬細胞系RAW264.7。將加熱、未加熱的UPM和AASD樣本分別配置成DMEM懸浮液,使其濃度均為3 mg/ml,觀察細胞生長狀態(tài)良好。每個培養(yǎng)皿中加入40μl的UPM或AASD懸浮液,使其終濃度為30μg/ml,在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)3 h后提取RNA。 11 RT-PCR ISOGEN提取RNA后,冰上操作反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,進行RT-PCR分析TLRs和NALP3炎癥復(fù)合體的基因表達。 12、統(tǒng)計學(xué)分析 本研究應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析,統(tǒng)計結(jié)果表述為平均數(shù)±標準差,采用單因素方差分析比較不同染毒組的實驗數(shù)據(jù)；當(dāng)組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義時,采用SNK法進行組間比較,p0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。 實驗結(jié)果 1、附著于顆粒物表面的真菌檢測 在未加熱的UPM和AASD表面明顯呈現(xiàn)熒光,該現(xiàn)象表明未經(jīng)過加熱處理的顆粒物表面吸附了真菌微生物。 2、顆粒物中化學(xué)成分、水溶性成分、脂多糖和β-葡聚糖的含量 UPM中的主要化學(xué)成分為二氧化硅(約占32%)和碳(約占12%)。AASD中的主要化學(xué)成分為二氧化硅(約占60%)。UPM和AASD均含有一定量的SO42-、NO3-、Cl-、NH4+、LPS和β-葡聚糖；而經(jīng)過加熱處理的UPM和AASD中上述水溶性成分、LPS和β-葡聚糖的含量均未檢測到。 3、顆粒物致小鼠肺部病理學(xué)改變的觀察 OVA+UPM和OVA+AASD聯(lián)合處理組的小鼠肺支氣管上皮中杯狀細胞顯著增殖,在PAS反應(yīng)中呈現(xiàn)粉色,呼吸道周圍結(jié)締組織中有明顯的嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤,其病理學(xué)改變分別強于OVA+H-UPM和OVA+H-AASD聯(lián)合處理組。 4、顆粒物對小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞分布的影響OVA+UPM和OVA+AASD聯(lián)合處理組小鼠的支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞以及淋巴細胞數(shù)量顯著高于其他各處理組。 5、顆粒物對小鼠支氣管肺泡灌洗液中細胞因子和趨化性細胞因子表達的影響 與OVA單獨處理組相比,OVA+UPM和OVA+AASD聯(lián)合處理組小鼠的支氣管肺泡灌洗液中細胞因子IL-4、IL-5、IL-12和趨化性細胞因子MCP-1、MCP-3、嗜酸性粒細胞趨化因子的蛋白表達顯著增加。 6、顆粒物對小鼠血清中OVA特異性IgE和IgG1表達的影響 與OVA單獨處理組相比,OVA+UPM和OVA+AASD聯(lián)合處理組小鼠的血清中OVA特異性IgE和IgG1抗體的表達明顯增加。 7、顆粒物對鼠巨噬細胞中TLR2和TLR4 mRNA表達的影響 與對照組相比,AASD使小鼠巨噬細胞中TLR2表達mRNA顯著增加,而TLR4表達mRNA顯著減少,H-AASD處理組的mRNA表達無顯著變化。 8、亞洲沙塵暴浮塵顆粒物對小鼠巨噬細胞中NALP3炎癥復(fù)合體mRNA表達的影響 與對照組相比,AASD使小鼠巨噬細胞中NALP3炎癥復(fù)合體的基因表達顯著增加,H-AASD處理組NALP3炎癥復(fù)合體的基因表達無顯著變化。 結(jié)論 1、北京城市空氣顆粒物和亞洲沙塵暴浮塵顆粒物通過增加Th2反應(yīng)相關(guān)的細胞因子和趨化性細胞因子的表達而激活Th2免疫反應(yīng),進而加重OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠的氣道炎癥反應(yīng)；城市空氣顆粒物和亞洲沙塵暴浮塵中的二氧化硅成分以及吸附于顆粒物表面的燃料燃燒產(chǎn)物、真菌、細菌可能在上述反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。 2、亞洲沙塵暴浮塵顆粒物導(dǎo)致小鼠巨噬細胞中TLR2和NALP3炎癥復(fù)合體基因表達增加。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R562.25
【部分圖文】：

學(xué)分析用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，統(tǒng)計結(jié)果表述為平均數(shù)差分析比較不同染毒組的實驗數(shù)據(jù);當(dāng)組間差異具有統(tǒng)計進行組間比較，p<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果從SD表面的真菌檢，lj結(jié)果行真菌菌系Y染色后AASD表面的熒光檢測結(jié)果。未經(jīng)過加現(xiàn)明顯的綠色熒光，該現(xiàn)象表明AASD表面吸附了大量的真

核細胞中激活的caspase一l能夠激活并分泌白細胞介素一lp(interleuxin一lp，IL一lp)[80]。當(dāng)NALP3與ASC相互作用激活caspase一1時，形成細胞內(nèi)復(fù)合物即為NALP3炎癥復(fù)合體困ALP3Infl~asome)[25，27]。研究表明在病原菌提取分子、無菌炎癥誘導(dǎo)物及無病原微生物的成孔毒素等多種前炎癥因子刺激的反應(yīng)中NALP3炎癥復(fù)合體被激活并持續(xù)表達[8I一82]。Airl.r.e月口加.s..d腸.吐

0對小鼠巨噬細胞中NLRp3mRNA表達的影響D導(dǎo)致小鼠巨噬細胞中NLRP3基因表達明顯高于對照組和H一AA;而經(jīng)過加熱處理的H一AASD對于小鼠巨噬細胞中NLRP3基因0.12
【引證文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉青青;陳麗;;大氣細顆粒物對兒童哮喘影響的研究進展[J];環(huán)境與健康雜志;2012年07期

本文編號：2862976