發(fā)布時間：2020-11-11 07:41

　　 IκBα突變體靶向抑制NF-κB對哮喘血清-內皮穿越模型中樹突狀細胞分化的研究 樹突狀細胞(dendritic cell,DC)作為體內已知功能最強的抗原呈遞細胞(antigen presenting cell,APC),在免疫激活以及免疫耐受中發(fā)揮重要作用�！癟h1/Th2偏移”假說是哮喘發(fā)病的主要免疫學機制,近期研究認為哮喘是機體對變應原的“免疫耐受”機制異常和/或缺陷而導致體內Th1/Th2偏移。而DC的類型、成熟狀態(tài)以及局部微環(huán)境在決定Th0細胞向調節(jié)性T細胞或效應性T細胞分化中起著關鍵作用。DC分化發(fā)育成熟依賴于核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)激活。利用未成熟DC誘導T細胞耐受在許多免疫性疾病中得到了應用,但用于哮喘預防和治療的成功報道還很少。因人外周血DC數(shù)目有限,目前對DC的研究往往依賴于體外誘導培養(yǎng)體系如GM-CSF和IL-4誘導體系,但實際上在體內很難出現(xiàn)如此高水平的細胞因子內環(huán)境。最近,權威雜志Science相繼報道了模擬正常人單核細胞在體內遷移分化發(fā)育成DC的內皮細胞穿越模型和正常人單核細胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中2～3天分化為DC的研究。因此,本課題首先構建內皮細胞穿越模型,研究正常人外周血CD14+單核細胞是否能在正常人血清和哮喘患者血清中通過此模型分化為DC,并比較單核細胞在正常血清和哮喘血清條件下分化的DC表型、功能的差異;然后以不易降解的新穎NF-κB超強抑制劑(AdIκBαM)轉染正常人外周血單核細胞,利用哮喘患者血清誘導該單核細胞在內皮細胞單層中發(fā)生逆穿越,觀察AdIκBαM靶向抑制NF-κB是否影響單核細胞在哮喘血清-內皮穿越模型中分化為DC,并進一步探討其對分化細胞的表型和功能的影響。 第一部分支氣管哮喘血清對單核細胞內皮(逆)穿越分化的樹突狀細胞表型及功能的影響 目的利用內皮穿越模型研究支氣管哮喘患者血清對正常人單核細胞分化而來的DC表型及功能的影響。方法分離、培養(yǎng)臍靜脈內皮細胞,分別以20%正常人血清(正常血清組)和哮喘患者血清(哮喘血清組)培養(yǎng)基重懸正常人外周血CD14+單核細胞,加入內皮細胞單層上,48 h后收集逆穿越內皮的細胞。同時以新鮮分離單核細胞和培養(yǎng)48 h單核細胞為對照。Giemsa染色及光學顯微鏡觀察細胞形態(tài);流式細胞術(FCM)檢測細胞表型;混合淋巴細胞反應(MLR)檢測細胞刺激同源異體CD4+ T細胞增殖的能力;ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清液中IL-12 p70、IL-10水平;Western-blot檢測細胞胞漿IκBα和NF-κB p65表達。結果正常血清和哮喘血清均可誘導正常人單核細胞在內皮穿越模型中逆穿越分化為樹枝樣突起的細胞(endothelial-associated dendritic cell,eDC),其表面單核細胞標志CD14表達顯著下降,而共刺激分子CD80、CD86表達增高。與正常血清組相比,哮喘血清組eDC表面CD80、CD83表達明顯增高(分別P0.05、P0.01),而CD86、HLA-DR的表達及刺激T淋巴細胞增殖的能力無顯著差異(P均0.05)。哮喘血清組eDC培養(yǎng)上清中IL-12 p70、IL-10分泌均高于正常人血清組(分別P0.05、P0.01)。另外,Western-blot檢測發(fā)現(xiàn),與正常血清組比較,哮喘血清組細胞胞漿pIκBα表達增加,而NF-κB p65表達降低。結論正常人單核細胞在正常血清和哮喘血清均可逆穿越內皮分化為eDC樣細胞,哮喘患者血清則進一步通過部分上調eDC表面分子的表達、促使其分泌IL-10、IL-12p70而誘導eDC的成熟。 第二部分IκBα突變體靶向抑制NF-κB對哮喘血清-內皮穿越模型中樹突狀細胞分化的影響 目的觀察IκBα突變體轉染對正常人CD14+單核細胞在哮喘血清-內皮穿越模型中DC分化及其功能的影響。方法分離、培養(yǎng)臍靜脈內皮細胞。正常人CD14+單核細胞分為3組:未轉染組、AdLacZ(β-半乳糖苷酶)轉染組和AdIκBαM轉染組。20%哮喘患者血清重懸單核細胞,加入內皮細胞單層上,48 h后收集逆穿越細胞。⑴Western-blot法檢測逆穿越細胞胞漿中IκBα、IκBαM的表達;Giemsa染色及光學顯微鏡觀察細胞形態(tài);流式細胞術(FCM)檢測細胞表面分子CD14、CD80、CD86、CD83及HLA-DR的表達;酶聯(lián)免疫法( ELISA)分析細胞培養(yǎng)上清中IL-12 p70和IL-10的水平;混合淋巴細胞反應(MLR)分析細胞刺激同種異體CD4+ T淋巴細胞增殖的能力;免疫熒光技術及電泳遷移率試驗(EMSA)檢測細胞中NF-κB活性。⑵逆穿越細胞經(jīng)室塵螨變應原(Der p 1)刺激后,與同種異體CD4+ T淋巴細胞共培養(yǎng)72 h。ELISA方法測定培養(yǎng)液中IL-4和IFN-γ水平;Western-blot方法測定T淋巴細胞中T-bet、GATA-3及逆穿越細胞(eDC)中STAT6、pSTAT6表達水平。結果⑴Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)AdIκBαM轉染單核細胞逆穿越分化而來的細胞胞漿中出現(xiàn)突變型(外源性) IκBαM基因,該細胞仍表現(xiàn)為樹枝樣突起,與未轉染單核細胞分化而來的細胞一樣低表達單核細胞標志CD14。而其表面分子CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表達、IL-12 p70的分泌及刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力均顯著低于未轉染組和AdLacZ轉染組分化細胞( P均 0.05),且AdIκBαM轉染組分化細胞的NF-κB p65核表達陽性率和NF-κB DNA結合灰度值較未轉染組和AdLacZ轉染組顯著降低( P均 0.05)。⑵未轉染組和AdLacZ轉染組分化細胞經(jīng)Der p 1刺激后誘導CD4+ T淋巴細胞產(chǎn)生IL-4和IFN-γ,以IFN-γ顯著升高(P 0.01),而AdIκBαM組分化細胞抑制T淋巴細胞產(chǎn)生IL-4和IFN-γ,伴隨著T淋巴細胞中T-bet、GATA-3及eDC中pSTAT6表達降低。結論⑴AdIκBαM轉染單核細胞可經(jīng)內皮穿越分化為未成熟eDC樣細胞。⑵AdIκBαM轉染單核細胞來源的eDC在接觸變應原后仍保持未成熟狀態(tài),并且可能通過抑制eDC中IL-12 p70分泌和STAT6激活而抑制T-bet、GATA-3表達,而阻止T淋巴細胞向Th1/Th2分化。 第三部分過表達IκBα突變體的樹突狀細胞對哮喘CD4+CD25+調節(jié)性T細胞作用的研究 目的探討哮喘患者外周血中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞數(shù)目與功能的變化及過表達IκBα突變體單核細胞來源的eDC對哮喘患者外周靜脈血中調節(jié)性T細胞的影響。方法⑴流式細胞術(FCM)檢測哮喘組和正常對照組外周靜脈血中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞占CD4+ T細胞的百分比;分離CD4+CD25+調節(jié)性T細胞,與CD4+ T細胞、室塵螨變應原(Der p 1)共培養(yǎng)72 h,四唑鹽比色(MTT)法檢測CD4+ T細胞增殖。⑵分離、培養(yǎng)臍靜脈內皮細胞。正常人CD14+單核細胞分為:未轉染組、AdLacZ轉染組和AdIκBαM轉染組。用20 %哮喘患者血清重懸單核細胞,加入內皮細胞單層上,48 h后收集的逆穿越細胞與哮喘患者外周血中CD4+CD25- T細胞及室塵螨變應原(Der p 1)共培養(yǎng)72 h,流式細胞術(FCM)檢測CD4+ T細胞中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞百分比,酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測上清液中IL-10及TGF-β1含量。結果⑴哮喘組外周血中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞占CD4+ T細胞百分比低于正常對照組(P0.05);CD4+CD25+調節(jié)性T細胞能抑制哮喘CD4+ T細胞增殖,而哮喘組與正常組CD4+CD25+調節(jié)性T細胞抑制CD4+ T細胞增殖的能力無顯著差異(P均0.05)。⑵與未轉染組eDC和AdLacZ組eDC相比,過表達IκBα突變體的eDC能誘導哮喘患者CD4+CD25- T細胞向CD4+CD25+調節(jié)性T細胞極化并分泌IL-10 (P均 0.05)。結論⑴CD4+CD25+調節(jié)性T細胞數(shù)目減少可能是導致哮喘患者免疫失調的重要原因。⑵過表達IκBαM基因的eDC在體外能促進哮喘CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的分化,增加抑制性細胞因子IL-10的分泌。提示DC在誘導T淋巴細胞對過敏原的免疫耐受過程中起十分重要的作用。
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R562.25
【部分圖文】：

經(jīng)典激活途徑：IκB激酶(IKK)誘導IκBα N端絲氨酸32/36磷酸化/p65二聚體入核。B，旁路激活途徑：NF-κB誘導激酶(NIK)誘導I活化, 從而導致p100發(fā)生磷酸化依賴性剪切, 生成有活性的p52:并進入細胞核與靶基因結合, 調節(jié)基因的表達。圖 2 NF-κB 的經(jīng)典和旁路激活途徑Ser32 Ser36DRHDSGLDS MKD×MV S plice + PolyAIκBαM cDNA以編碼蛋氨酸（M，203-205 bp）的 ATG 作為起始密碼，定點克隆的 IκBαM 基因（203-1003 bp），正好去除了其上游的 Ser32 和 Se化位點，推導的新穎 IκBαM 蛋白分子量為 30 kDa。

倒置顯微鏡下見：臍靜脈內皮細胞呈鋪路石樣鑲嵌排列的胞為扁平多角形(×100)；B，間接免疫熒光染色：細胞核周圍胞綠色熒光(選自 6 次實驗中的 1 次)。圖 1.1 臍靜脈內皮細胞的鑒定35

未穿越單核細胞逆穿越細胞A，倒置顯微鏡觀察，未穿越單核細胞表面光滑，而逆穿越細胞表面有毛刺狀突起；B：Giemsa 染色：未穿越單核細胞表面平滑，而逆穿越細胞表面有毛刺狀突起(×400)。(選自 6 次實驗中的 1 次)。圖 1.2 單核細胞源 eDC 的形態(tài)36
【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 張明順;張江全;王慧娟;柯瑤;劉衍春;季曉輝;李玉峰;;內皮細胞穿越模型中系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者樹突狀細胞分化及功能狀態(tài)的初步研究[J];中華風濕病學雜志;2006年01期

2 ;Effects of adenoviral gene transfer of mutated IκBα,a novel inhibitor of NF-κB,on human monocyte-derived dendritic cells[J];Acta Pharmacologica Sinica;2006年05期

3 覃壽明;施煥中;覃雪軍;陳一強;鐘小寧;;支氣管哮喘患者外周血中的CD_4~+CD_(25)~+T淋巴細胞的測定[J];中華結核和呼吸雜志;2006年04期

本文編號：2878931