發(fā)布時間：2020-11-10 21:51

　　 研究目的:局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)是與足細胞損傷相關的一種臨床病理綜合征。自從20世紀30年代初對這種臨床病理現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)以來,各種研究揭示了有關FSGS的可能潛在的發(fā)病機制,包括:由于足細胞結構或功能固有的缺陷而引起的原發(fā)性FSGS;由體脂含量過高、病毒等外源物質、藥物、循環(huán)因子等誘導的繼發(fā)性FSGS;某些單基因突變所造成的與遺傳因素相關的FSGS。然而FSGS的具體致病原因仍然是未知的,大量研究顯示與足細胞相關的單基因的變異參與了FSGS的發(fā)病過程。我們課題組分別探索了NPHS1,COL4A5,APOL1三種足細胞相關基因,從生物信息學分析、臨床個案報道以及對細胞形態(tài)和功能的影響等不同角度開展研究。期望檢測出與FSGS相關的變異,并初步探討其致病機制,以利于臨床診斷和預后。研究方法:(1)收集既往文獻中報道的關于NPHS1基因突變的信息,匯總后作為參考。從千人基因組數(shù)據(jù)庫中篩選出包含2504名健康受試者的NPHS1突變信息作為正常對照。臨床收集309名散發(fā)型FSGS患者,運用基于36種基因的Panel的二代測序和全外顯子組測序的方法,進行NPHS1基因變異檢測。在患者中統(tǒng)計出錯義突變位點后,分別用三種軟件進行致病性的預測。分析測序和預測的結果并結合nephrin蛋白結構繪制熱點功能域圖。(2)對1例有腎臟病家族史的腎活檢證實為FSGS的患者,進行IV型膠原免疫組織化學染色,并提取外周血DNA進行全外顯子測序,尋找可能的致病突變。(3)基于前期研究,構建定點突變位點的APOL1質粒,通過電穿孔方法將定點突變的質粒和購買的野生型質粒轉染進生長狀態(tài)良好的足細胞。48小時后在顯微鏡下觀察比較突變型質粒對細胞形態(tài)的影響;利用Lipofectamine 3000脂質體方法將突變型和野生型質粒轉染進293T細胞,通過膜片鉗方法檢測其對細胞膜上氯離子通道的影響。研究結果:(1)在309名散發(fā)型FSGS患者中共找到17個錯義突變位點和1個剪切突變位點,其中有一個新的突變位點是在第19號外顯子中的c.G2638T,同時第28號外顯子中的35830957 CT剪接突變也是一個新的突變位點。通過軟件預測共發(fā)現(xiàn)5個突變位點可能會導致FSGS的發(fā)生。大部分錯義突變位點集中在nephrin蛋白Ig1,Ig3,Ig7和C-末端細胞跨膜區(qū)域。(2)患者的腎臟組織免疫組織化學染色結果顯示,IV型膠原抗體染色結果COL4A5組表達低于正常對照組。全外顯子測序結果發(fā)現(xiàn)COL4A5基因第20位氨基酸出現(xiàn)異常,顯示為移碼突變。綜合診斷該名患者確診為表現(xiàn)出FSGS激素敏感性的由COL4A5基因新突變所引起的Alport綜合征的病例(3)APOL1基因會使足細胞發(fā)生溶解和破裂現(xiàn)象,新發(fā)現(xiàn)的突變會造成足細胞大面積的形態(tài)異常,甚至導致成團的聚集和死亡。同時,該基因會上調細胞膜氯離子通道的電流值,隨著電壓的升高,突變組對氯離子流動影響顯著。研究結論:我們分別從三個足細胞相關的熱點基因展開遺傳學研究,從不同層面探討基因突變對中國FSGS患者的影響。結果表明,NPHS1基因突變在我國FSGS患者中較為常見,但我國FSGS遺傳背景與西方人有較大差異且存在多個突變位點與FSGS存在一定的相關性。新發(fā)現(xiàn)的COL4A5基因突變位點可能為Alport綜合征的致病性遺傳位點,建議臨床將病理結果結合基因檢查報告對復雜的病例進行綜合性診斷,提高診斷精準度,避免不必要的激素用藥。在我國患者中發(fā)現(xiàn)的APOL1基因的新突變會造成足細胞形態(tài)的損傷并可能破壞細胞氯離子通道,從而導致FSGS的發(fā)生。
【學位單位】：電子科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R692
【部分圖文】：

NPHsl基因錯義突變在不同人群中的位點總結

是 Ig1 和跨膜結構域分別出現(xiàn)兩個突變。這些突變區(qū)域與以往其他地區(qū)的報道顯示既有重合也有不同之處，提示 NPHS1 基因在我國散發(fā)型 FSGS 患者中的突變與其他地區(qū)的情況有所不同。2.2.3 中國 FSGS 患者突變位點所在功能域分析我們針對本研究中所發(fā)現(xiàn)的17個錯義突變，結合NPHS1基因外顯子和nephrin蛋白功能域的對應關系，繪制出突變熱點功能域圖。雖然總體來說 NPHS1 基因突變位點在 nephrin 蛋白結構域中的分布情況仍然比較分散，這與我們前期總結出的突變結果相似，但是其中值得關注的是我們的研究結果顯示 Ig3 和 Ig7 兩個結構域發(fā)生致病性突變的概率相對集中且突變率較高。我們將找到的錯義突變與 nephrin 蛋白功能域相對應繪制成如圖 2-4 所示。我國 FSGS 患者突變主要集中在 Ig1，Ig3，Ig7 和 C-末端細胞跨膜區(qū)域，這與前期研究報道顯示在 Ig1 和 Ig7 結構域中觀察到多數(shù) NPHS1 突變的情況一致。說明這些結構域可能為 NPHS1 基因突變的熱點功能域。

第三章 COL4A5 基因新突變在繼發(fā)性 FSGS 患者中的報道 7）12,000 rpm 條件下離心兩分鐘后棄廢液。將吸附柱 CB3 室溫條時間，使內壁上殘余的 PW 揮發(fā)干凈。8）將吸附柱轉入提前滅菌離心管中，槍頭位置控制在中部上空滴沖液 TE，室溫放置數(shù)分鐘。9）12,000 rpm 條件下離心兩分鐘，將溶液收集到離心管中備用。果家系調查 3-2 所示，先證者過去沒有明顯病史，其母親于先證者發(fā)病時間毒癥逝世，其外婆去世病因不詳。
【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 彭婷;李貴森;;載脂蛋白L1基因突變及其相關疾病的研究進展[J];中華腎臟病雜志;2016年05期

本文編號：2878377