發(fā)布時間：2020-11-12 06:07

　　 背景移植排斥引起的慢性腎間質纖維化一直是移植腎慢性功能喪失的主要原因,其主要病理改變表現(xiàn)為腎小管萎縮伴隨間質纖維組織增生,主要特點是肌成纖維細胞活化分泌細胞外基質。腎纖維化時有關肌成纖維細胞目前認為可能有多種來源,包括:腎內(nèi)固有成纖維細胞的激活、骨髓內(nèi)細胞的遷移來源、從腎小管上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞以及血管周細胞的轉化而來。其中腎小管上皮細胞經(jīng)上皮間充質轉分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)一直是移植慢性纖維化不可忽視的來源之一。腎移植急性排斥反應組織學上雖形態(tài)多樣,其主要特征是炎細胞(免疫細胞)的浸潤,可表現(xiàn)為腎間質炎、小管炎和動脈內(nèi)膜炎。相對于動脈內(nèi)膜炎,以腎間質炎、小管炎為表現(xiàn)的急性腎排斥反應更為常見,特別是小管炎病變輕重可直接反映急性排斥的嚴重程度。近年來急性排斥反應浸潤的巨噬細胞與移植腎慢性纖維化形成可能的相關性開始逐漸引起人們的關注。曾有報道急性排斥反應浸潤巨噬細胞越嚴重,其腎移植后1年、2年和4年移植腎功能狀態(tài)越差,提示巨噬細胞浸潤可能與移植腎慢性纖維化形成密切相關。我們前期研究顯示:激活的巨噬細胞與體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細胞NRK52E共培養(yǎng)后,可使培養(yǎng)的NRK52E出現(xiàn)明顯的上皮標記物表達降低、同時出現(xiàn)間充質細胞標記物,即出現(xiàn)NRK52E的EMT;隨之質譜分析顯示激活的巨噬細胞后分泌多種細胞因子包括:TGF-β1(轉化生長因子-β1)、IL-6(白細胞介素-6)、補體C3、Hsp90(熱休克蛋白90)、MMP9(基質金屬蛋白酶9)、Osteopontin(骨橋蛋白)和TNF-α(腫瘤壞死因子-α)。TGF-β1作為公認纖維因子,可誘導腎小管細胞發(fā)生EMT,進而可能參與纖維化的形成。除了TGF-β1外,激活巨噬細胞分泌的其他因子是否也具有誘導腎小管上皮細胞發(fā)生EMT,進而參與腎纖維化進程尚不十分明確。本研究我們選擇細胞因子IL-6,觀察單獨的IL-6是否具有誘導體外培養(yǎng)NRK52E發(fā)生表型轉化、進而發(fā)生EMT的能力。目的以大鼠腎小管上皮細胞株NRK52E為研究對象,檢測IL-6誘導體外培養(yǎng)的NRK52E發(fā)生由上皮細胞表型向間充質細胞表型轉化的能力。方法選擇:E-鈣粘蛋白(E-Cadherin,E-Ca)和細胞角蛋白-19(Cytokeratin,CK19)作為上皮細胞標記物,α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)作為間充質細胞標記物。以終濃度分別為25ng/ml,50ng/ml和100ng/ml IL-6,在培養(yǎng)基DMEM中分別誘導培養(yǎng)NRK52E細胞24小時、48小時和72小時,同時以等體積IL-6溶解劑為對照組,先在倒置顯微鏡下觀察不同誘導時間對照組和各誘導組NRK52E細胞的形態(tài)學變化,再以Real-Time qPCR方法分別檢測各組細胞其上皮細胞標記物和間充質細胞標記物mRNA表達。同樣以終濃度50ng/ml IL-6,誘導培養(yǎng)NRK52E細胞24小時、48小時和72小時,Western Blot方法檢測上皮細胞標記物和間充質細胞標記物的蛋白表達。再以終濃度50ng/ml IL-6,誘導培養(yǎng)NRK52E細胞72小時,免疫細胞化學和免疫熒光染色進一步檢測和驗證上皮細胞標記物和間充質細胞標記物蛋白表達。結果形態(tài)學觀察:體外培養(yǎng)的NRK52E對照組細胞在培養(yǎng)過程中始終保持貼壁生長,基本呈典型的鵝卵鋪路石樣,并且細胞間銜接緊密。而各誘導組細胞在誘導培養(yǎng)24小時后,均可見細胞出現(xiàn)有短梭形樣,隨著IL-6濃度的升高,細胞梭形越明顯;繼續(xù)誘導培養(yǎng)48和72小時后,各誘導組細胞見細胞長梭形愈加明顯,提示IL-6可以使體外培養(yǎng)的NRK52E細胞發(fā)生形態(tài)學改變,從典型的上皮細胞的鵝卵石樣形態(tài)變?yōu)槎趟笮魏退笮?而且隨著IL-6培養(yǎng)時間的延長、濃度的增加,細胞向梭形形態(tài)的改變越明顯。Real-Time qPCR結果:在不同濃度的IL-6誘導培養(yǎng)NRK52E細胞24小時和48小時后,各誘導組細胞上皮標記物CK19、E-Ca的mRNA表達與對照組相比無明顯差異,而間充質細胞標記物α-SMA、vimentin mRNA表達在誘導培養(yǎng)24小時后出現(xiàn)了短暫一過性的明顯低于對照組細胞,繼續(xù)培養(yǎng)48小時后,各誘導組α-SMA、vimentin mRNA表達則迅速恢復到與對照組表達水平基本相一致,甚至出現(xiàn)了在IL-6濃度為50ng/ml誘導組細胞培養(yǎng)48小時后,α-SMA mRNA表達明顯高于對照組細胞。當繼續(xù)誘導培養(yǎng)72小時后,上皮標記物CK19、E-Ca的mRNA表達均明顯降低,同時間充質標記物α-SMA、vimentin的mRNA表達則明顯升高且與對照組相比差異顯著,說明IL-6誘導培養(yǎng)NRK52E細胞72小時后,細胞出現(xiàn)了明顯的上皮細胞表型向間充質細胞表型的改變或稱表型轉化。Western Blot結果:濃度為50ng/ml的IL-6體外誘導NRK52E,誘導培養(yǎng)24小時和48小時后,其上皮細胞標記物CK19、E-Ca及間充質標記物vimentin的蛋白表達與相應的對照組相比未見有明顯變化,但α-SMA的蛋白表達則表現(xiàn)為在培養(yǎng)24小時后出現(xiàn)了一過性明顯低于相應對照組細胞,但當繼續(xù)培養(yǎng)48小時后α-SMA的蛋白表達則迅速恢復,并表現(xiàn)為其表達明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義。當繼續(xù)培養(yǎng)72小時后,與對照組相比,誘導組細胞上皮CK19、E-Ca蛋白表達量均低于對照組,同時間充質標記物α-SMA、vimentin的蛋白表達則明顯高于對照組,Western Blot蛋白表達結果與上述Real-time qPCR檢查結果相一致。免疫細胞化學染色結果顯示,NRK52E細胞在50ng/ml濃度的IL-6體外誘導72h后,對照組細胞見有上皮標記物E-Ca明確強陽性染色、呈線性分布于細胞膜,同時其間充質標記物vimentin則染色陰性。而誘導組細胞上皮標記物E-Ca的染色僅表現(xiàn)為弱陽性染色,同時間充質標記物vimentin出現(xiàn)了明確的陽性染色。免疫熒光染色結果與免疫細胞化學染色結果相一致,即IL-6誘導培養(yǎng)NRK52E72小時后,誘導組細胞上皮標記物E-Ca免疫熒光染色明顯減弱,同時出現(xiàn)了明顯的間充質標記物vimentin明確陽性染色。免疫細胞化學和免疫熒光染色進一步驗證了IL-6誘導培養(yǎng)NRK52E細胞72小時后,細胞出現(xiàn)了明顯的細胞表型轉化。總之,從細胞形態(tài)、mRNA表達水平和蛋白表達水平均顯示,IL-6可誘導體外培養(yǎng)的NRK52E細胞發(fā)生由上皮細胞表型向間充質細胞表型的改變或稱表型轉化。結論IL-6可以成功的誘導體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞株NRK52E細胞出現(xiàn)由上皮細胞表型向間充質細胞表型的改變或稱表型轉化。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R699.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 文獻綜述
        1.1.1 腎間質纖維化
        1.1.2 腎小管上皮細胞上皮-間充質轉分化
        1.1.3 慢性移植腎纖維化與巨噬細胞
    1.2 引言
第2章 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 細胞株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 其他試劑
    2.2 主要儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 腎小管上皮細胞（NRK52E）的培養(yǎng)、傳代、凍存與復蘇
        2.3.2 IL-6 體外誘導NRK52E細胞
        2.3.3 倒置顯微鏡觀察誘導后的NRK52E細胞形態(tài)改變
        2.3.4 Real-Time qPCR檢測誘導培養(yǎng)的NRK52E細胞表型轉化
        2.3.5 Western Blot檢測誘導培養(yǎng)的NRK52E細胞表型轉化
        2.3.6 免疫細胞化學和免疫熒光檢測誘導培養(yǎng)的NRK52E細胞表型轉化
    2.4 統(tǒng)計學分析
第3章 實驗結果
    3.1 IL-6 誘導NRK52E細胞后的細胞形態(tài)學改變
    3.2 Real-Time qPCR檢測IL-6 誘導NRK52E細胞表型轉化
    3.3 Western Blot檢測IL-6 誘導NRK52E細胞表型轉化
    3.4 免疫細胞化學染色檢測IL-6 誘導NRK52E細胞表型轉化
    3.5 免疫熒光染色檢測IL-6 誘導NRK52E細胞表型轉化
第4章 討論
第5章 結論
參考文獻
作者簡介
致謝

【參考文獻】

相關碩士學位論文 前2條

1 杜偉;活化的巨噬細胞誘導腎小管上皮細胞轉分化[D];吉林大學;2015年

2 陳爽;TGF-β1誘導腎小管上皮細胞發(fā)生轉分化狀態(tài)研究[D];吉林大學;2008年

本文編號：2880359