α-parvin在維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)態(tài)中的作用研究
發(fā)布時(shí)間：2021-01-28 00:15
腎小球疾病是威脅全球人類健康的公共衛(wèi)生問題,給家庭及社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)壓力,是當(dāng)今研究的前沿?zé)狳c(diǎn)和重點(diǎn)方向。足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷是多種腎小球疾病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。但至今人們對多種腎小球疾病尤其是足細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷的發(fā)病機(jī)制、研究防治及相關(guān)干預(yù)的措施仍缺乏準(zhǔn)確系統(tǒng)的了解,針對腎小球疾病的治療手段尚為稀少。因此,深入研究足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制,明確誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的信號(hào)通路,將為腎小球疾病的防治提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。α-parvin是一種極其重要的黏著斑蛋白,通過連接整合素和肌動(dòng)蛋白骨架參與細(xì)胞骨架定位,調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而在細(xì)胞粘附、伸展、存活等方面起著重要作用。然而,目前關(guān)于α-parvin在維持足細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能中的作用仍無任何相關(guān)報(bào)道。為了探究α-parvin在足細(xì)胞中的作用,本研究運(yùn)用Cre-Lox P重組酶系統(tǒng)成功構(gòu)建足細(xì)胞特異性敲除α-parvin小鼠（α-parvin Neph2c KO）。研究發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞特異性敲除α-parvin會(huì)造成小鼠足細(xì)胞損傷（足細(xì)胞凋亡、裂孔隔膜蛋白組織異常）,進(jìn)而導(dǎo)致腎小球衰竭（腎小管膨脹、糖原沉積、腎小球和腎間質(zhì)纖維化）,最終導(dǎo)...
【文章來源】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 985工程院校
【文章頁數(shù)】：58 頁
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
腎臟結(jié)構(gòu)示意圖[20]
哈爾濱工業(yè)大學(xué)工程碩士學(xué)位論文-7-結(jié)構(gòu)不清，瘢痕形成。臨床上常見，多臟器功能損傷與衰竭表現(xiàn)；應(yīng)及時(shí)有效地行透析來緩解中毒癥狀和嚴(yán)重尿毒癥并發(fā)癥的處理，提高生活與生存質(zhì)量，延長生命。1.5α-parvin的生理結(jié)構(gòu)α-parvin蛋白是黏著斑蛋白Parvin蛋白家族中的一員。大約2000年時(shí)，NikolopoulosandTuner在實(shí)驗(yàn)室中從大鼠全DNA中分離和克隆出一個(gè)全新的F-actin和PaxillinLD1殘基結(jié)合蛋白，將其命名為Actopaxin[30]。Tu等人在利用酵母雙雜交篩選ILK的結(jié)合伙伴時(shí)，鑒定并克隆了一種新的含有兩個(gè)鈣結(jié)合蛋白同源結(jié)構(gòu)域（Calpainhomologousdomain，CH1、CH2）的ILK結(jié)合蛋白，并由此命名為含有ILK結(jié)合蛋白的鈣同源結(jié)構(gòu)域或CH-ILKBP（CalponinHomologydomain-containingILKBindingProtein）[31]�；谂cα-actin結(jié)合區(qū)的序列同源性，Olski等鑒定并克隆了3種結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白，分別命名為α、β和γ-parvin[32]。α-parvin在N端含有兩個(gè)鈣調(diào)節(jié)蛋白同源結(jié)構(gòu)域（CH1、CH2）和核定位序列（NLS），是一種由N端多肽和2個(gè)鈣結(jié)合蛋白同源結(jié)構(gòu)域（Calpainhomologousdomain、CH1、CH2）串聯(lián)而成的銜接蛋白。這種結(jié)構(gòu)域使a-parvin能夠?qū)⒔z狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）募集到其定位位點(diǎn)并與應(yīng)力纖維結(jié)合。同時(shí)結(jié)合包括整合素連接激酶（Integrinlinkedkinase，ILK）和Paxilin在內(nèi)的多種伴侶分子。并通過C端與ILK、PINCH形成PIP復(fù)合物，被招募到整合素富集黏附位點(diǎn)，與β-integrins的尾部結(jié)合，耦聯(lián)到細(xì)胞骨架激動(dòng)蛋白上，接受胞外信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞骨架的穩(wěn)態(tài)，激活信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞的行為及形態(tài)發(fā)生過程，如圖1-2所示。圖1-2α-parvin蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖[33]α-parvin蛋白由N端多肽和兩個(gè)鈣調(diào)節(jié)蛋白同源結(jié)構(gòu)域（CH1、CH2）串聯(lián)而成，主要通過
哈爾濱工業(yè)大學(xué)工程碩士學(xué)位論文-31-圖3-1成功構(gòu)建足細(xì)胞特異性敲除α-parvin小鼠（α-parvinNeph2cKO）a)α-parvinNeph2cKO小鼠模型的構(gòu)建策略。表達(dá)Neph2-Cre的小鼠與α-parvin2、3號(hào)外顯子兩側(cè)攜帶LoxP位點(diǎn)的小鼠雜交。b）鼠尾全基因組DNAPCR分析。α-parvin-/-基因條帶大小為502bp，而α-parvinflox/flox的條帶大小為636bp。Cre基因條帶大小為412bp。c）α-parvinNeph2cKO小鼠和同窩WT小鼠離體足細(xì)胞α-parvin蛋白免疫印跡分析。d）對α-parvinNeph2cKO小鼠和同窩WT小鼠進(jìn)行腎切片α-parvin蛋白和Nephrin蛋白免疫雙熒光染色。標(biāo)尺10μm。上面版中白框所選定區(qū)域的放大圖如下面版的圖像表示。圖b-d代表3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。E=Exon；fl=flox；WT=wild-type。3.3本章小結(jié)由于全身性敲除α-parvin會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎致死，因而我們選定足細(xì)胞特異性敲除α-parvin小鼠（α-parvinNeph2cKO）來探究α-parvin在腎小球足細(xì)胞中的作用。利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)（Neph2-Cre）錨定α-parvin基因2、3號(hào)外顯子得到α-parvinNeph2cKO小鼠。經(jīng)過鼠尾基因組DNAPCR分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所有小鼠的出生均遵循孟德爾遺傳定律且LoxP序列及Cre序列均插入正確。之后我們提取了原代足細(xì)胞進(jìn)行了蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了小鼠腎臟足細(xì)胞中α-parvin蛋白的敲除，除此以外我們利用免疫熒光標(biāo)簽染色證實(shí)α-parvinNeph2cKO小鼠足細(xì)胞中α-parvin蛋白的敲除，上述結(jié)果綜合表明我們成功構(gòu)建了足細(xì)胞特異性敲除α-parvin小鼠。
本文編號(hào)：3003997
【文章來源】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 985工程院校
【文章頁數(shù)】：58 頁
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
腎臟結(jié)構(gòu)示意圖[20]
哈爾濱工業(yè)大學(xué)工程碩士學(xué)位論文-7-結(jié)構(gòu)不清，瘢痕形成。臨床上常見，多臟器功能損傷與衰竭表現(xiàn)；應(yīng)及時(shí)有效地行透析來緩解中毒癥狀和嚴(yán)重尿毒癥并發(fā)癥的處理，提高生活與生存質(zhì)量，延長生命。1.5α-parvin的生理結(jié)構(gòu)α-parvin蛋白是黏著斑蛋白Parvin蛋白家族中的一員。大約2000年時(shí)，NikolopoulosandTuner在實(shí)驗(yàn)室中從大鼠全DNA中分離和克隆出一個(gè)全新的F-actin和PaxillinLD1殘基結(jié)合蛋白，將其命名為Actopaxin[30]。Tu等人在利用酵母雙雜交篩選ILK的結(jié)合伙伴時(shí)，鑒定并克隆了一種新的含有兩個(gè)鈣結(jié)合蛋白同源結(jié)構(gòu)域（Calpainhomologousdomain，CH1、CH2）的ILK結(jié)合蛋白，并由此命名為含有ILK結(jié)合蛋白的鈣同源結(jié)構(gòu)域或CH-ILKBP（CalponinHomologydomain-containingILKBindingProtein）[31]�；谂cα-actin結(jié)合區(qū)的序列同源性，Olski等鑒定并克隆了3種結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白，分別命名為α、β和γ-parvin[32]。α-parvin在N端含有兩個(gè)鈣調(diào)節(jié)蛋白同源結(jié)構(gòu)域（CH1、CH2）和核定位序列（NLS），是一種由N端多肽和2個(gè)鈣結(jié)合蛋白同源結(jié)構(gòu)域（Calpainhomologousdomain、CH1、CH2）串聯(lián)而成的銜接蛋白。這種結(jié)構(gòu)域使a-parvin能夠?qū)⒔z狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）募集到其定位位點(diǎn)并與應(yīng)力纖維結(jié)合。同時(shí)結(jié)合包括整合素連接激酶（Integrinlinkedkinase，ILK）和Paxilin在內(nèi)的多種伴侶分子。并通過C端與ILK、PINCH形成PIP復(fù)合物，被招募到整合素富集黏附位點(diǎn)，與β-integrins的尾部結(jié)合，耦聯(lián)到細(xì)胞骨架激動(dòng)蛋白上，接受胞外信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞骨架的穩(wěn)態(tài)，激活信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞的行為及形態(tài)發(fā)生過程，如圖1-2所示。圖1-2α-parvin蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖[33]α-parvin蛋白由N端多肽和兩個(gè)鈣調(diào)節(jié)蛋白同源結(jié)構(gòu)域（CH1、CH2）串聯(lián)而成，主要通過
哈爾濱工業(yè)大學(xué)工程碩士學(xué)位論文-31-圖3-1成功構(gòu)建足細(xì)胞特異性敲除α-parvin小鼠（α-parvinNeph2cKO）a)α-parvinNeph2cKO小鼠模型的構(gòu)建策略。表達(dá)Neph2-Cre的小鼠與α-parvin2、3號(hào)外顯子兩側(cè)攜帶LoxP位點(diǎn)的小鼠雜交。b）鼠尾全基因組DNAPCR分析。α-parvin-/-基因條帶大小為502bp，而α-parvinflox/flox的條帶大小為636bp。Cre基因條帶大小為412bp。c）α-parvinNeph2cKO小鼠和同窩WT小鼠離體足細(xì)胞α-parvin蛋白免疫印跡分析。d）對α-parvinNeph2cKO小鼠和同窩WT小鼠進(jìn)行腎切片α-parvin蛋白和Nephrin蛋白免疫雙熒光染色。標(biāo)尺10μm。上面版中白框所選定區(qū)域的放大圖如下面版的圖像表示。圖b-d代表3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。E=Exon；fl=flox；WT=wild-type。3.3本章小結(jié)由于全身性敲除α-parvin會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎致死，因而我們選定足細(xì)胞特異性敲除α-parvin小鼠（α-parvinNeph2cKO）來探究α-parvin在腎小球足細(xì)胞中的作用。利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)（Neph2-Cre）錨定α-parvin基因2、3號(hào)外顯子得到α-parvinNeph2cKO小鼠。經(jīng)過鼠尾基因組DNAPCR分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所有小鼠的出生均遵循孟德爾遺傳定律且LoxP序列及Cre序列均插入正確。之后我們提取了原代足細(xì)胞進(jìn)行了蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了小鼠腎臟足細(xì)胞中α-parvin蛋白的敲除，除此以外我們利用免疫熒光標(biāo)簽染色證實(shí)α-parvinNeph2cKO小鼠足細(xì)胞中α-parvin蛋白的敲除，上述結(jié)果綜合表明我們成功構(gòu)建了足細(xì)胞特異性敲除α-parvin小鼠。
本文編號(hào)：3003997
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