發(fā)布時(shí)間：2020-11-11 05:08

　　 目的:制備純鈦表面重組人生長因子DOPA-IGF1涂層,構(gòu)建鈦片表面同時(shí)兼?zhèn)浯龠M(jìn)細(xì)胞早期黏附狀態(tài)和成骨活性的單一材料涂層。研究DOPA-IGF1對(duì)鈦片表面兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響,以期為種植體表面改性提供新的研究方向。方法:1、對(duì)攜有重組人生長因子DOPA-IGF1目的基因的菌種進(jìn)行表達(dá)和純化,通過SDS-PAGE電泳水凝膠對(duì)純化后蛋白DOPA-IGF1進(jìn)行鑒定。2、利用對(duì)目標(biāo)蛋白DOPA-IGF1的羥化,將其固定在鈦片表面,構(gòu)建涂層體系。通過掃描電鏡(SEM)觀察各組鈦片的表面形貌、X線能譜分析(EDX)測(cè)定各組試樣表面元素組成,對(duì)各組鈦片進(jìn)行表征。3、采用全骨髓貼壁法提取兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs),傳代培養(yǎng)至第三代時(shí)通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK-8)測(cè)定增殖曲線,對(duì)其進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后,通過茜素紅染色和成骨相關(guān)基因檢測(cè)驗(yàn)證其成骨分化潛能。4、通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、熒光染色檢測(cè)各組涂層鈦片,研究DOAP-IGF1對(duì)rBMSCs增殖和早期粘附狀態(tài)的影響。5、通過堿性磷酸酶(ALP)實(shí)驗(yàn)對(duì)共培養(yǎng)成骨誘導(dǎo)后ALP表達(dá)水平的測(cè)定和對(duì)成骨相關(guān)基因Runx2、BMP2、Col-a1相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定,探究DOPA-IGF1對(duì)rBMSCs成骨相關(guān)活性的影響。結(jié)果:1、成功提取并培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,顯微鏡下觀察細(xì)胞呈長梭形有序排列,成骨誘導(dǎo)后驗(yàn)證了其成骨分化潛能。2、掃描電鏡、X線能譜分析結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)成功在鈦片表面制備DOPA-IGF1涂層,并表現(xiàn)出理想的涂層形貌。3、CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,細(xì)胞增殖速率為DOPA-IGF1組IGF-1組TI組(P0.05),TI組與CG組增殖率無顯著差別(P0.05)。結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)所用鈦片對(duì)rBMSCs的生長無明顯影響,DOPA-IGF1涂層能夠顯著促進(jìn)鈦片表面rBMSCs的早期增殖。4、熒光染色結(jié)果顯示,IGF-1組與TI組細(xì)胞形態(tài)相近,呈團(tuán)塊狀,激動(dòng)蛋白微絲不清晰;DOPA-IGF1組細(xì)胞較其他兩組細(xì)胞伸展出的偽足多,肌動(dòng)蛋白微絲清晰可見,細(xì)胞延展性更好。5、ALP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長,四組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性逐漸增強(qiáng)。堿性磷酸酶活性DOPA-IGF1組IGF-1組TI組,TI組與CG組無顯著差別,DOPA-IGF1組與IGF-1組差異顯著(P0.05),DOPA-IGF1組與TI組和CG組相比差異顯著(P0.05)。6、成骨相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果顯示,在成骨誘導(dǎo)4、7d時(shí)DOPA-IGF1組3種成骨相關(guān)基因表達(dá)均增強(qiáng),且與其他組相比差異顯著(P0.05)。結(jié)論1、成功提取并培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并對(duì)其鑒定,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)所提取細(xì)胞的生物學(xué)特性與干細(xì)胞相符合。2、成功構(gòu)建覆DOPA-IGF1及覆IGF-1涂層的實(shí)驗(yàn)組件,通過掃描電鏡與X線能譜分析對(duì)涂層進(jìn)行表征。3、通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明DOPA-IGF1對(duì)rBMSCs早期增殖的促進(jìn)作用,初步證實(shí)其促成骨作用,但其促成骨機(jī)制和效果尚需進(jìn)一步研究。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R783.1
【部分圖文】：

第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提取、培養(yǎng)和鑒定.1 rBMSCs 提取和培養(yǎng)結(jié)果顯微鏡下觀察原代（P0）rBMSCs 生長緩慢，多表現(xiàn)為散落、三角形形態(tài)，其間混有圓形、類圓形雜質(zhì)細(xì)胞，見圖 3.1（代（P3）rBMSCs 生長速度明顯加快，細(xì)胞集落間相互融合密排列，呈輻射狀或菊花狀，細(xì)胞大小形態(tài)均勻，呈長梭形3.1（B）。

顯微鏡下觀察 rBMSCs 成骨誘導(dǎo)后茜素紅化結(jié)果 Ni-NTA 填料的親和層析柱進(jìn)行純化依然留有高濃度的咪唑。使用填料為脫鹽純化。蛋白表達(dá)和純化過程中的檢測(cè)分析。DOPA-IGF1 的理論分子子量一致，DOPA-IGF1 以可溶狀態(tài)表白濃度為 498.63ug/ml。結(jié)果表明，本長因子 DOPA-IGF1。

圖 3.2 倒置顯微鏡下觀察 rBMSCs 成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色（×100）3.2 蛋白表達(dá)純化結(jié)果上清液經(jīng)過 Ni-NTA 填料的親和層析柱進(jìn)行純化。表達(dá)和純程后，蛋白質(zhì)中依然留有高濃度的咪唑。使用填料為 Sephadex 脫鹽柱進(jìn)一步脫鹽純化。蛋白表達(dá)和純化過程中的所有組分SDS-PAGE 電泳檢測(cè)分析。DOPA-IGF1 的理論分子量是 10.7kd 泳圖中的蛋白分子量一致，DOPA-IGF1 以可溶狀態(tài)表達(dá)，見圖 BCA 法測(cè)定蛋白濃度為 498.63ug/ml。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)成功表純化了重組人生長因子 DOPA-IGF1。
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