發(fā)布時間：2020-11-12 07:04

　　 目的:構建載有細胞的正交多層有序排列組織工程角膜基質,檢測其特征和活性,探索機械力壓縮及拉伸含角膜基質細胞的膠原及多層疊加手段,構建與自然角膜接近的仿生組織工程角膜基質并進行動物移植,探明構建的組織工程角膜基質形態(tài)學及分子生物學變化規(guī)律。方法:以原代提取的,體外擴增至第五代的新西蘭白兔角膜基質細胞(CSCs)作為組織工程角膜基質構建的種子細胞。利用塑壓膠原和拉伸膠原的技術,構建載有細胞的正交排列的4層壓縮膠原(CC)和拉伸壓縮膠原(SCC),并用谷氨酰胺轉氨酶對其進行交聯。然后CC和SCC進行7天的體外培養(yǎng),進行透光度和機械強度試驗。通過掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)檢測CC和SCC的表面和內部超微結構。利用活死細胞雙染試劑盒檢測細胞在CC和SCC中的存活率。通過熒光染色測量細胞的排列和長度。通過共聚焦顯微鏡檢測細胞的空間排列結構。WB和qPCR檢測CC、SCC和平板培養(yǎng)(TCP)中細胞的基因表達變化。RNA-seq檢測全轉錄組的表達差異,根據差異表達基因(DEGs)推測分子和通路的變化。最后通過兔角膜基質移植實驗檢測組織工程角膜基質的生物相容性和活性。結果:水化的CC、水化的SCC以及天然角膜基質的平均透光率分別為63.7%、73.8%和76.5%,脫水的CC、SCC和天然角膜基質平均透光率分別為87.7%、89.7%和98.5%。脫水的CC和脫水的SCC的拉伸強度分別為12.86±1.77 MPa和17.38±1.06 MPa。CC和SCC中CSCs的存活率分別為(83.5±3.7)%和(80.3±2.6)%,細胞長度分別為108.0±28.4μm和133.2±36.1μm。CC中的細胞為無序排列,SCC中的細胞為有序排列,分布在±30°之間。SEM和TEM顯示,CC中膠原纖維呈無序排列,而SCC中膠原纖維呈有序排列。共聚焦顯微鏡結果顯示,SCC中細胞呈多層正交排列,CC中細胞為無序排列。WB和qPCR結果顯示,與TCP組相比,CD34、lumican在CC和SCC中上調,I型膠原、α-SMA和β-actin下調。ACTA2、COL1A1、FN1、VIM、MKI67、SNAI1、G0S2顯著性下調,LUM和DCN顯著性上調。流式結果顯示,CC、SCC和TCP中細胞在G0/G1期的比例分別為56.0±2.9%、55.7±1.9%和49.9±1.4%,在S期的比例分別為24.9±0.3%、24.5±1.4%和34.8±2.3%,在G2/M期的比例分別為18.6±2.8%、19.5±0.5%和15.2±0.9%。CC和SCC在G0/G1和G2/M期的比例顯著提升,在S期的比例顯著下調。RNA-seq結果顯示,以TCP作為對照組,CC中有2440個基因下調,2324個基因上調;SCC中有2445個基因下調,2346個基因上調。以CC作為對照組,SCC中有58個基因下調,55個基因上調。細胞分裂和DNA復制相關信號通路下調,FoxO、PI3K-Akt、axon guidance、MAPK等信號通路顯著性上調。細胞骨架、膠原、激活、增殖等相關基因下調,基質金屬蛋白酶和間隙連接相關基因上調。體內研究表明,CC和SCC在移植入兔角膜基質6周后,透明度越來越高。CC和SCC中有細胞,對照組無細胞進入。且CC和SCC中細胞能正常表達CD34和vimentin,不表達α-SMA,CC與SCC和組織相容性較好。結論:通過機械力壓縮及拉伸含角膜基質細胞的膠原,制作了仿生組織工程角膜基質層,其具有多層有序正交排列、安靜型基質細胞和良好的生物相容性。不僅為今后的角膜和其他組織工程器官的設計提供了基礎和思路,而且提供了角膜和其他結締組織發(fā)育、生長、重塑、再生和纖維化病理相關有價值的新見解。
【學位單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R318
【部分圖文】：

他們具有良好的機械性能，而且利于細胞的生長和重塑，但是不人工設計成想要的形狀和特性。一些組織工程材料要求分層、有序排列的微構、細胞分布各向異性等，這就需要人工設計的組織工程結締組織支架滿足特點。塑壓膠原(plastic compressed collagen)，由 Brown 等人[44]在 2005 年發(fā)明一種較為理想的膠原組織工程制作方法。它的主要原理是通過外部壓力，快將膠原凝膠中的水分擠出，使膠原凝膠的密度和機械強度提升，而且可以控縮時間調整膠原凝膠的密度和水分。這種方法可以在幾分鐘之內最多排出 水分，同時對細胞的活性不會造成太大的影響[44]。一般地，整個塑壓膠原自上而下由配重、玻璃板、濾紙、尼龍網、膠原凝膠、尼龍網、濾紙組成。通過玻璃板將壓力均勻分散到膠原凝膠上，使其中的水分壓出，導致凝膠的(圖 1-1)。

he result of immunofluorescence in P0 CSCs and P5 CSCs. Keraressed in P0 CSCs. The signal of these two proteins is decreased in-related proteins collagen I and α-SMA are up-regulated in P5. P0 C α-SMA. Bar scale: 20 μm.CSCs 和第 5 代 CSCs 的 western blot 鑒定 的 CSCs 和 P5 的 CSCs，提取全細胞蛋白，進行 wester、CD34、lumican、collagen I 和 α-SMA 的表達水平進行檢果如圖 2-2。在 P0 的 CSCs 中，keratocyte 相關表型 kerat而在 P5 中幾乎檢測不到這兩個蛋白的信號。P0 和 P5 的成纖維細胞相關表型 collagen I 和 α-SMA，但在 P0 的

22圖 3-1.CC 和 SCC 的制作過程。(a)第 5 代的 CSCs 收集入 15ml 離心管中，加入 9ml0.5%預冷的膠原溶液和 1ml10×DMEM，充分混勻。(b)離心除氣泡，將膠原轉移至 3.5cm×3.5cm×2cm 的模具中，37°C 孵育 30min 使膠原溶液凝結。(c)取出膠原凝膠，在其兩側加上尼龍片。(d)膠原凝膠進行壓縮，兩側分別加上尼龍網和濾紙，最后蓋上玻璃板，100g 的砝碼對其進行壓縮，制成 CC。(e)當壓縮完成時，用拉伸機對膠原膜進行 1.2 倍長度拉伸，即得到 SCC。
【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

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2 胡曉潔,王敏,柴崗,張艷,李偉國,劉偉,曹誼林;組織工程技術構建兔角膜基質組織的實驗研究[J];中華眼科雜志;2004年08期

3 陳家祺,張勝,郭琳潔,鄭湖玲,林健賢,鄭健樑;應用三維培養(yǎng)技術體外重建角膜組織的初步研究[J];中華眼科雜志;2001年04期

本文編號：2880430