發(fā)布時間：2020-11-16 13:52

　　 目的:鈦(titanium,Ti)及其合金已成為牙列缺損及牙列缺失修復(fù)過程中廣泛使用的骨內(nèi)植入材料,但是由于缺乏生物活性和骨誘導(dǎo)性,鈦種植體植入機體后至少需要3-6個月才能實現(xiàn)骨整合。因此提高種植體表面生物活性、加快骨結(jié)合進(jìn)程已成為目前種植體表面改性的研究熱點,而鈦表面摻鍶(strontium,Sr)改性是有效手段之一。然而傳統(tǒng)的物理、化學(xué)等摻鍶改性方法操作步驟復(fù)雜、反應(yīng)條件苛刻、制備成本較高,所以需要尋求一種綠色簡單、經(jīng)濟高效的摻鍶改性策略。相轉(zhuǎn)變?nèi)芫��?phase-transited lysozyme,PTL)是一種新型的類淀粉樣材料,利用溶菌酶的相轉(zhuǎn)變過程可以構(gòu)建多種基材的表面功能化涂層。本研究利用PTL一步法制備載鍶涂層,并探究其對骨生成及骨免疫調(diào)節(jié)的影響。方法:1.在鈦表面構(gòu)建不同載鍶量的相轉(zhuǎn)變?nèi)芫�酶涂層作為實驗組,包括PTL、PTL@10Sr、PTL@20Sr、PTL@50Sr組;以拋光處理的空白鈦片(Ti)作對照組。對這五組鈦樣品進(jìn)行表面表征及緩釋實驗,使用場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)觀察各組樣品的表面形貌特征;X射線光電子能譜(XPS)剖析各組樣品的元素組成及比例;電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)分析各組樣品的離子釋放情況。2.各組鈦樣品進(jìn)行表征分析后,在其表面培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并檢測其粘附、伸展、增殖、遷移與成骨分化等情況。MTS實驗以及激光共聚焦顯微鏡(CLSM)用于觀察各組鈦表面細(xì)胞的早期黏附和伸展情況;通過MTS實驗分析細(xì)胞增殖情況;利用Transwell小室系統(tǒng)檢測各組鈦表面對細(xì)胞遷移的影響;各組鈦表面上細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后通過堿性磷酸酶試劑盒(ALP-Kit)檢測的其ALP活性、逆轉(zhuǎn)錄PCR測定成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2及骨鈣素Ocn的基因表達(dá)水平、蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光檢測RUNX2的蛋白表達(dá)水平。3.在各組鈦樣品表面培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7,通過逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測相關(guān)基因(如腫瘤壞死因子Tnfα、白細(xì)胞介素Il6、白細(xì)胞介素Il10、骨形態(tài)發(fā)生蛋白Bmp2、轉(zhuǎn)化生長因子Tgfβ1)的mRNA水平,評估巨噬細(xì)胞對不同鈦表面的響應(yīng)情況。建立巨噬細(xì)胞和BMSCs的共培養(yǎng)模型,利用Transwell小室系統(tǒng)、ALP-Kit和逆轉(zhuǎn)錄PCR試驗評估巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對BMSCs遷移以及成骨分化的影響。4.通過體內(nèi)實驗建立股骨植入模型,通過組織學(xué)分析檢測特定時間內(nèi)不同植入物周圍的炎癥情況及骨生成程度,進(jìn)一步驗證各組鈦樣品對骨生成的影響。結(jié)果:1.利用相轉(zhuǎn)變?nèi)芫�酶技術(shù)在鈦表面成功制備出不同載鍶量的PTL涂層。FE-SEM結(jié)果顯示PTL涂層呈類淀粉樣項鏈狀纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),均勻分布于鈦片表面。XPS結(jié)果表明PTL涂層以及載鍶PTL涂層都成功定植于鈦片表面。緩釋實驗表明載鍶PTL涂層能夠持續(xù)穩(wěn)定地釋放鍶離子。2.鈦表面培養(yǎng)BMSCs的增殖實驗結(jié)果表明,BMSCs在各組鈦表面均具有良好的活性,PTL涂層及鍶對細(xì)胞的增殖幾乎無影響;MTS和CLSM結(jié)果表明,PTL涂層及載鍶PTL涂層有利于BMSCs的早期黏附和伸展;載鍶PTL組,尤其是PTL@20Sr組表現(xiàn)出更強的促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力;同時多項實驗結(jié)果顯示載鍶PTL組,尤其是PTL@20Sr組更有利于BMSCs的成骨分化。3.逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗結(jié)果表明,與空白對照組相比,PTL@20Sr組更能降低巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥因子Tnfα、Il6的mRNA水平,同時促進(jìn)成骨相關(guān)基因Bmp2、Tgfβ1的表達(dá);而且PTL@20Sr組的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基更有利于BMSCs的遷移及成骨分化。4.體內(nèi)實驗結(jié)果表明,植入初期,PTL和PTL@20Sr組植入物周圍有較少的炎細(xì)胞浸潤;植入1個月后,PTL@20Sr組能夠觀察到更多的新骨生成。結(jié)論:本研究利用相轉(zhuǎn)變?nèi)芫�酶技術(shù)成功地將鍶修飾于鈦表面。體內(nèi)、體外實驗結(jié)果證明與對照組空白鈦表面相比,載鍶PTL涂層可以促進(jìn)BMSCs細(xì)胞粘附、伸展和遷移,促進(jìn)成骨分化;同時還可作用于巨噬細(xì)胞,影響免疫微環(huán)境,更好地誘導(dǎo)BMSCs成骨分化。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R783.1
【部分圖文】：

PTL 組可見均勻覆蓋在光滑鈦表面的相轉(zhuǎn)變?nèi)芫�酶涂層，呈類淀粉樣鏈狀纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；高倍鏡圖像（圖1.1E）顯示構(gòu)成 PTL 涂層的球形顆粒直徑約為 500nm。圖 1.1C 和圖 1.1F 為PTL@Sr 組的表面形貌觀察結(jié)果，其與 PTL 組基本相似。圖 1.1 各組鈦試樣表面 FE-SEM 觀察結(jié)果圖 (A、D) Ti 組, (B、E) PTL 組, (C、F) PTL@Sr 組1.2.2 各組鈦表面 X 射線光電子能譜分析圖 1.2 為 X 射線光電子能譜的分析結(jié)果，分別顯示了 Ti 組、PTL 組以及PTL@Sr 組的表面化學(xué)組成。所有的結(jié)合能均以 C1s 譜峰（284.8 eV）作為內(nèi)部參考進(jìn)行校準(zhǔn)。如圖 1.2A 所示，Ti 組的掃描光譜具有 C1s、Ti2p3（458eV）、O1s（530eV）和 N1s（399eV）譜峰，說明對照組空白鈦片主要元素成分包括 Ti、C、O 和 N。C1s 信號可能是由于環(huán)境中的污染所導(dǎo)致的波譜[45]。PTL 組（圖1.2B）中來自 TCEP 和溶菌酶的 P2p（132 eV）和 S2p（164 eV）特征峰的出現(xiàn)以及 Ti2p3 波峰的減弱表明 PTL 涂層已成功地將鈦基材覆蓋。這與 XPS 定量分析的數(shù)據(jù)結(jié)果一致（表 1.1）。圖 1.2C 中可見結(jié)合能為 270eV 的 Sr3p3 特征峰，這表明鍶離子已成功地沉積在 PTL 改性層中。

C1s 信號可能是由于環(huán)境中的污染所導(dǎo)致的波譜[45]。PTL 組（圖1.2B）中來自 TCEP 和溶菌酶的 P2p（132 eV）和 S2p（164 eV）特征峰的出現(xiàn)以及 Ti2p3 波峰的減弱表明 PTL 涂層已成功地將鈦基材覆蓋。這與 XPS 定量分析的數(shù)據(jù)結(jié)果一致（表 1.1）。圖 1.2C 中可見結(jié)合能為 270eV 的 Sr3p3 特征峰，這表明鍶離子已成功地沉積在 PTL 改性層中。

表 1.1 各組鈦試樣表面元素組成的 XPS 檢測分析1.2.3 各組鈦片鍶離子釋放情況圖1.3顯示了28d內(nèi)鈦表面不同載鍶涂層的釋放動力學(xué)。鍶離子在PTL@10Sr、PTL@20Sr、PTL@50Sr 組中顯示出類似的減少趨勢。緩釋實驗進(jìn)行的第一天所有試樣均有突釋現(xiàn)象出現(xiàn)，三天后逐漸進(jìn)入平穩(wěn)釋放期，這一時期 PTL@10Sr、PTL@20Sr 和 PTL@50Sr 組中鍶的平均日釋放量分別為 0.181μg/mL 、0.288μg/mL 和 0.572μg/mL。而且在同一檢測時間，各組涂層釋放的鍶離子量遵循以下規(guī)律 PTL@50Sr 組>PTL@20Sr 組> PTL@10Sr 組。C% N% O% Ti% P% S% Sr%Ti61.47±0.234.64±0.0926.94±0.126.95±0.300 0 0PTL64.40±0.2116.28±0.0618.34±0.2000.16±0.050.83±0.070PTL@Sr58.69±0.3716.87±0
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本文編號：2886305