眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子誘導肝星狀細胞凋亡中的差異蛋白質(zhì)表達及驗證
發(fā)布時間:2019-01-10 20:45
【摘要】:目的:從眼鏡蛇毒中分離出具有生物學活性的蛇毒神經(jīng)生長因子(Nervegrowthfactor,NGF),分析蛇毒NGF對肝星狀細胞(Hepaticstellatecells,HSC)凋亡、增殖及蛋白質(zhì)表達的影響,從細胞和蛋白組學水平探討蛇毒NGF抗纖維化作用的機理。 實驗方法: 根據(jù)實驗目的不同設計的分組實驗方法具體如下: (1)貼壁細胞的MTT實驗分組:用單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞設為空白對照組,用眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子進行干預(干預濃度依次為1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)的細胞設為實驗組; (2)流式細胞術實驗分組:用單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞設為空白對照組,用眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子進行干預(干預濃度依次為2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)的細胞設為實驗組; (3)雙向電泳實驗分組:用單純培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞設為空白對照組,用眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子進行干預(干預濃度依次為2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)的細胞設為實驗組。 方法: (1)眼鏡蛇毒NGF通過ShephadexG-75凝膠柱和CMSepharoseCL-6B離子膠柱二步色譜法進行分離純化; (2)各洗脫峰的生物學活性用PC12細胞測定,具有NGF生物學活性的洗脫峰純度和相對分子質(zhì)量用SDS-PAGE電泳方法鑒定; (3)采用MTT法檢測HSC-T6細胞的增殖是否受蛇毒NGF的影響; (4)采用流式細胞術檢測HSC-T6細胞的凋亡是否受蛇毒NGF的影響; (5)采用雙向電泳的方法探究HSC-T6細胞蛋白質(zhì)表達在蛇毒NGF干預前后是否存在差異; (6)對雙向凝膠電泳中差異表達在1.8倍及以上的蛋白質(zhì)點采用質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術進行鑒定; (7)對鑒定出的表達具有差異的蛋白質(zhì)點,利用生物信息學手段進行分析(蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、GO分類及STRING網(wǎng)絡); (8)蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot,WB)對差異的蛋白質(zhì)點進行驗證。 結果: (1)眼鏡蛇毒粗毒經(jīng)ShephadexG-75凝膠柱粗分離得到3個峰,第二峰峰尖具有NGF活性;具有NGF活性的第二峰經(jīng)過CMSepharoseCL-6B離子膠柱再分離得到5個峰; (2)將上述各個峰分別作用于PC12細胞,結果顯示具有明顯神經(jīng)生長因子活性的是第Ⅲ峰。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對分離的神經(jīng)蛇毒生長因子進行檢測為電泳純,其分子量經(jīng)計算得22.3KD; (3)MTT實驗結果表明蛇毒神經(jīng)生長因子對HSC-T6細胞的增殖有明顯的抑制作用:NGF濃度為1μg/ml時的抑制率為(25.1±2.1)%,濃度為5μg/ml時的抑制率為(48.2±1.9)%,明顯高于對照組的抑制率(23.8±1.8)%,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05); (4)在流式細胞術實驗中通過檢測發(fā)現(xiàn)蛇毒生長因子能夠誘導HSC-T6細胞發(fā)生凋亡:在NGF濃度為2μg/ml時的凋亡率為(16.16±3.02)%,5μg/ml時的凋亡率為(22.15±3.31)%,10μg/ml時的凋亡率為(31.28±2.16)%,明顯高于對照組的凋亡率(4.36±1.85)%,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05); (5)空白對照組和被蛇毒NGF干預的雙向電泳圖譜經(jīng)比對分析后,共47個蛋白質(zhì)點有表達差異,有22個在蛇毒神經(jīng)生長因子干預組上表達增加,另有25個表達減少;隨著NGF濃度的變化,一些差異蛋白質(zhì)的表達也隨之變化; (6)對上述表達差異在1.8倍及以上的共18個蛋白質(zhì)點,,利用質(zhì)譜技術進行肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)進行分析,鑒定出13個蛋白質(zhì); (7)對這些差異蛋白質(zhì)利用生物信息學的手段進行分析,發(fā)現(xiàn)在細胞分化增殖、信號傳導通路、細胞氧化代謝、生物調(diào)節(jié)等過程起著十分重要的作用; (8)蛋白質(zhì)印記法結果顯示:TGF-β蛋白質(zhì)在對照組高表達,被NGF干預后,其表達能力隨著神經(jīng)生長因子濃度的增加而逐漸降低,呈負相關;與此同時,RHOA蛋白質(zhì)在神經(jīng)生長因子干預的條件下的表達增加,并且隨著神經(jīng)生長因子濃度的增大而逐漸增大,呈正相關。 結論: (1)具有生物活性的神經(jīng)生長因子能夠從眼鏡蛇毒中分離純化得到; (2)蛇毒神經(jīng)生長因子對HSC-T6細胞的增殖起到明顯的抑制作用; (3)蛇毒神經(jīng)生長因子對HSC-T6細胞的凋亡具有誘導作用; (4)蛇毒神經(jīng)生長因子能使HSC-T6細胞蛋白質(zhì)發(fā)生差異性表達; (5)發(fā)生差異性表達的蛋白質(zhì)應該是在肝纖維化過程中的關鍵因素,這些蛋白質(zhì)能夠通過信號轉(zhuǎn)導通路參與生物調(diào)節(jié),可能通過這種方式來實現(xiàn)抗肝纖維化的目的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】:廣西醫(yī)科大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2014
【分類號】:R575.2
本文編號:2406766
[Abstract]:......
【學位授予單位】:廣西醫(yī)科大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2014
【分類號】:R575.2
【參考文獻】
相關期刊論文 前5條
1 潘頻華;黃四云;胡成平;;神經(jīng)生長因子誘導背根節(jié)感覺神經(jīng)元細胞iNOS和P物質(zhì)的表達及干擾素調(diào)節(jié)因子-1的作用(英文)[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2011年05期
2 賴允麗;張學榮;張欽樂;胡仁統(tǒng);羅小玲;廖明;班建東;;眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子抑制肝星狀細胞增殖并誘導其凋亡[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2012年06期
3 韋傳寶;;蛇毒神經(jīng)生長因子的應用研究進展[J];實用醫(yī)學雜志;2007年13期
4 劉成海,劉平,胡義揚,朱大元;丹酚酸B鹽對轉(zhuǎn)化生長因子-β1刺激肝星狀細胞活化與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的作用[J];中華醫(yī)學雜志;2002年18期
5 程明亮;細胞信號轉(zhuǎn)導與功能蛋白質(zhì)組學在肝纖維化發(fā)生機制研究中的新動向[J];中西醫(yī)結合肝病雜志;2005年04期
本文編號:2406766
本文鏈接:http://www.wukwdryxk.cn/yixuelunwen/xiaohjib/2406766.html
最近更新
教材專著