發(fā)布時間：2020-11-18 22:21

　　 研究背景和目的： 腸缺血再灌注(intestinal ischemia-reperfusion，IIR)是發(fā)生多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的重要病理生理過程。全身炎癥反應(yīng)(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是IIR后MODS發(fā)生的重要發(fā)病機理，早期干預(yù)炎癥反應(yīng)，積極防治MODS，是降低危重病患者病死率的重要手段。 全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的發(fā)生取決于機體的免疫系統(tǒng)。傳統(tǒng)上免疫系統(tǒng)分為天然免疫和獲得性免疫。我們課題組前期工作表明獼猴IIR后并發(fā)SIRS及MODS的發(fā)病過程中，腸粘膜TLRs-NF-κB-炎癥介質(zhì)信號轉(zhuǎn)導通路全面激活，但IgA、SC、SIgA均顯著減少，表現(xiàn)為腸粘膜過強天然免疫與降低的獲得性體液免疫共同存在。IFN-γ是免疫炎癥反應(yīng)的一種重要調(diào)控因子，對天然免疫和獲得性免疫均有調(diào)控作用，但IFN-γ是否參與IIR后腸粘膜免疫反應(yīng)及SIRS的形成?如果參與，是通過何種機制?細胞因子常與其它激素，神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)共同組成細胞間信號分子系統(tǒng)，如果IFN-γ參與了腸黏膜免疫活動，生長抑素(somatostatin，SST)是否影響IFN-γ的產(chǎn)生?通過這方面的研究，以期增進我們對IIR后腸黏膜免疫的認識，并為防治SIRS、MODS提供新的思路。 急性重癥胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是導致IIR的常見病因，在SAP—IIR—MODS的發(fā)生中，IIR反過來對胰腺組織病理及功能又有何影響?自SST用于治療SAP以來，有效降低了MODS發(fā)病率。SST的這些作用究竟僅僅是因為抑制了胰酶分泌，還是可以避免IIR后SIRS對胰腺的再次打擊?這方面的研究將更新臨床防治MODS或SAP的思路，并增加我們對SST在抗炎藥理方面的認識。 傳統(tǒng)認為，B細胞介導的獲得性免疫在腸粘膜免疫中具有重要的作用。我們研究小組前期的實驗表明IIR后，大鼠腸淋巴細胞歸巢增加，獼猴PP(peyer’s patches，PP)內(nèi)B細胞明顯增多，但是腸粘膜獲得性體液免疫效應(yīng)卻表現(xiàn)為sIgA減少。新近研究表明，B淋巴細胞具有獲得性免疫及天然免疫的雙重功能。那么IIR時PP內(nèi)大量集聚的B細胞是否參與腸黏膜增強天然免疫的形成?如果有，是哪一類或哪一發(fā)育階段的B細胞?參與天然免疫的B細胞是否包括具有免疫記憶的B淋巴母細胞?這些研究能增進我們對臨床防治SIRS及MODS分子靶點的新認識。 方法： 1．實驗動物：全部實驗所用健康成年獼猴來自成都野生動物世界，雌雄不限，體重6.9±1.7Kg。獼猴進出成都野生動物世界獼猴喂養(yǎng)區(qū)時均檢疫合格。 2．實驗分組：15只健康成年獼猴隨機分為正常、IIR、IIR+SST三組，每組5只動物。腸缺血再灌注手術(shù)：肌注復方二甲苯胺噻嗪(0.06～0.24ml／kg)麻醉動物，實驗過程中用安定靜注0.16±0.09mg／kg／h維持昏睡狀態(tài)。無菌鋪巾，沿腹正中切開，分離腸系膜上動脈后予以夾閉，60 min后松夾進行再灌注，恢復腸系膜上動脈血流。再灌注后1h，靜脈輸入0.9％鹽水，0.1～0.2ml／kg／min，24h內(nèi)補入葡萄糖20g。 3．預(yù)防使用SST：在夾閉腸系膜上動脈前，從靜脈滴注生長抑素，5μg／kg／h，持續(xù)至再灌注后24h。 4．HE染色法觀察回腸、胰腺組織病理損傷程度。 5．放射免疫分析檢測外周血SST的含量。 6．ELISA檢測腸上皮細胞、腸淋巴細胞、腸淋巴細胞孵育上清液、回腸組織勻漿、外周血清、門靜脈血清中IFN-γ的水平。 7．ELISA檢測外周血清及回腸組織勻漿中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。 8．酶比色法檢測血清淀粉酶及脂肪酶。 9．免疫組化檢測IFN-γ、CD4、CD8、CD57、CD20、CD5、PAX-5、漿細胞、TLR4、TLR2、NF-κB、integrinα4β7的分布，圖像分析軟件測定陽性面積及IOD值。 10．門靜脈血培養(yǎng)。 11．培養(yǎng)人B淋巴母細胞株hmy2.cir，細胞干預(yù)組加入LPS(10μg／ml)，另一組為無干預(yù)的空白對照組，37℃，5％CO_2孵育。 12．ELISA檢測干預(yù)24小時后培養(yǎng)上清液中IL—6及干預(yù)72小時后培養(yǎng)上清液中IgM的水平。 13．免疫熒光檢測hmy2.cir細胞TLR2、TLR4表達。 14．MTT檢測LPS干預(yù)hmy2.cir細胞株后24小時、48小時、72小時的增殖情況 結(jié)果： 1．IIR后回腸粘膜上皮細胞、門靜脈血內(nèi)IFN-γ水平較正常組顯著增加(分別為30.7±20.1 pg／mg vs 9.4±2.4pg／mg總蛋白；18.1±1.1pg／ml vs 8.7±1.3 pg／m1)，p＜0.05，而腸淋巴細胞及其上清液的IFN-γ水平較正常組明顯降低(分別為1.7±0.02pg／mg vs 11.1±4.0pg／mg總蛋白；2.2±0.3pg／mg ys 5.2±1.5pg／mg)(p＜0.05)； 2．預(yù)防性給予SST后，與IIR組比較，回腸上皮細胞及門靜脈血內(nèi)IFN-γ的水平顯著下降(分別為13.6±4.9pg／mg總蛋白，p=0.055；8.9±2.5pg／ml，p＜0.05)，腸淋巴細胞及其上清液的IFN-γ水平無明顯變化； 3．組織勻漿及外周血的IFN-γ水平在三組間無明顯差別。CD4~+細胞、CD57~+細胞分布與IFN-γ無關(guān)，CD8~+細胞分布與IFN-γ變化趨勢相反。 4．IIR后小腸黏膜PP數(shù)量增加、增大。 5．正常組獼猴腸黏膜PP內(nèi)的B細胞均為PAX-5~+ CD20~+ CD5~-，系B-2細胞，黏膜固有層有散在漿細胞。IIR后PP內(nèi)PAX-5~+細胞顯著增加(p＜0.05)，但其中CD20表達未見增多，CD5~-表達，出現(xiàn)PAX-5~+ CD20~- CD5~-的祖B細胞，黏膜固有層內(nèi)漿細胞顯著減少(p＜0.05)。 6．正常時，PP中TLR2、TLR4、NF-κB及IFN-γ表達均較弱，IIR時PP內(nèi)四種分子表達均明顯增強。 7．正常PP內(nèi)有散在α4β7表達，IIR組明顯減少。 8．IIR后，獼猴外周血及回腸黏膜組織中炎癥介質(zhì)IL-1β(外周血：79.2±14.4ng／ml；回腸：294.0±46.4pg／g)、IL-6(外周血：1261±297.5ng／ml；回腸：1527±160.8p／g)、TNF-α(外周血：64.8±18.7ng／ml；回腸：213.2±29.2pg／g)，與正常組IL-1β(外周血：27.3±7.17ng／ml；回腸：82.8±20.5pg／g)、IL-6(外周血：13.9±10.50ng／ml；回腸：709.6±211.2pg／g)、TNF-α(外周血：3.04±1.01ng／ml；回腸：56.0±10.04pg／g)比較，均顯著增加(p＜0.05)。SST治療后，外周血中IL-1β(40.0±9.9ng／ml)、IL-6(244.4±70.0 ng／ml)、TNF-α(19.2±10.1 ng／ml)水平明顯下降，與IIR組相比有顯著性差異(p＜0.05)。 9．正常組5只動物的門靜脈血培養(yǎng)均為陰性；IIR組所有獼猴血培養(yǎng)均有細菌生長，陽性率為100％，而且引起菌血癥的細菌均為大腸桿菌。 10．LPS干預(yù)72小時后，hmy2.cir細胞上清液中IgM水平為0.528±0.002 ng／ug總蛋白，與空白對照組(0.617±0.057ng／ug總蛋白)相比顯著減少(p＜0.05)。 11．LPS干預(yù)72小時后，與對照組相比，hmy2.cir細胞TLR4的IOD(1201.3±913.4 vs 5078.2±2483.2)及TLR2的IOD(174.8±80.2 vs 1463.5±51.2)較對照組顯著減少(p＜0.05)。 12．LPS干預(yù)24小時后，hmy2.cir細胞上清液中IL-6水平(0.528±0.002 pg／ug總蛋白)與空白對照組(0.406±0.218pg／ug總蛋白)相比顯著減少(p＜0.05)。 13．LPS干預(yù)24小時后，hmy2.cir細胞增殖水平(0.389±0.061)較空白對照組(0.727±0.245)為低，72小時后細胞增殖水平(0.562±0.219)較對照(0.173±0.079)顯著增加(p＜0.05)。 14．IIR后，所測胰淀粉酶(2 492.0±2 102.8 IU／L vs 385.4±136.1 IU／L)及脂肪酶(1 278.0±1 446.3 IU／L VS 25.8±13.0 IU／L)在血中水平較正常組均顯著升高(p＜0.05)。預(yù)防性使用SST，既使發(fā)生IIR，血胰淀粉酶(567.0±338.0 IU／L)及血脂肪酶(77.2±779 IU／L)明顯回落。 15．放射免疫分析結(jié)果表明，IIR后外周血SST(62.17±13.56 pg／ml)較正常對照(160.61±33.84 pg／ml)明顯下降(p＜0.05)，靜脈補充SST后，循環(huán)SST水平(156.32±30.25 pg／ml)顯著回升(p＜0.05)。 16．IIR時可見胰腺組織病理損傷。預(yù)防性使用SST后，胰腺病理組織學較IIR時明顯減輕，組織學評分從+++降到++。 結(jié)論： 1．IIR后，來源于上皮細胞及早期祖B細胞大量產(chǎn)生IFN-γ，后果是通過腸、黏膜、肺泡肥大細胞上的FcεRIα活化肥大細胞，引起強烈的天然免疫反應(yīng)。換言之，IFN-γ將TLR-NF-κB與肥大細胞兩個天然免疫反應(yīng)通路聯(lián)系在一起，構(gòu)成了復雜、高效的天然免疫網(wǎng)絡(luò)。 2．IIR后祖B細胞參與腸黏膜天然免疫反應(yīng)，在腸黏膜屏障嚴重損傷時常伴發(fā)LPS血癥，這使得LPS可在循環(huán)甚至骨髓中通過祖B細胞的TLR介導使祖B細胞迅速卷入天然免疫，在循環(huán)中產(chǎn)生大量IL-1β、IL-6、TNF-α，這應(yīng)是SIRS發(fā)生的重要原因之一。 3．IIR后腸黏膜PP內(nèi)PAX-5~+ CD20~+ CD5~-、具有免疫記憶的B淋巴母細胞并未在強烈、快速反應(yīng)的天然免疫中發(fā)揮明顯作用。 4．整個B淋巴細胞群具有天然免疫及獲得性免疫的雙重功能。在不同發(fā)育階段的B淋巴細胞僅分別發(fā)揮其中某一項功能。代表早期發(fā)育階段的祖B淋巴細胞高表達TLRs，且能被LPS激活，經(jīng)TLR-NF-κB-促炎因子途徑發(fā)揮快速、強烈的天然免疫功能；成熟B細胞具有較弱的天然免疫作用，主要參與獲得性免疫；代表發(fā)育晚期階段的B淋巴母細胞雖有TLRs表達，但不能被LPS激活，不具有天然免疫功能。 5．IIR導致MODS時，胰腺應(yīng)為值得重視的、早期受損的器官。其炎癥組織病理改變，不是缺血后氧化應(yīng)激所致，而與循環(huán)中炎癥介質(zhì)進入胰腺后激活NF-κB有關(guān)。SST可通過降低全身炎癥反應(yīng)，解除血炎癥介質(zhì)對胰腺的再次損傷，從而避免急性胰腺炎向重癥方向發(fā)展。
【學位單位】：四川大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2007
【中圖分類】：R574;R459.7
【部分圖文】：

536.7士318.7#與正常比較，爭<0.05;與IIR比較，卜0.05圖1一1稱猴小腸勃膜IFN一的表達(免疫組化，X4oo)二、ELIsA定量分析回腸、外周血及門靜脈血I剛一Y水平回腸上皮細胞的丁N一下水平變化趨勢同免疫組化結(jié)果，但腸淋巴細胞及其上清液的環(huán)N一下水平在IIR后明顯降低勿<0.05)，預(yù)防性給予SST后，仍不能恢復到正常水平。I皿后，門靜脈血IFN一Y較正常時顯著升高，預(yù)防性給予SST后，正N一Y水平明顯回落

結(jié)果一、稱猴回腸PP結(jié)的變化與正常組比較，llR時小腸豁膜PP數(shù)量增加、增大(圖2一1)。正常對照HR圖2一1稱猴回腸PP結(jié)的變化(HE，X100)二、PP內(nèi)B淋巴細胞及固有膜內(nèi)漿細胞的變化正常組稱猴腸勃膜PP內(nèi)的B細胞均為PAx一5+cD20+cDS一，系B一2細胞，勃膜固有層有散在漿細胞。HR時，PP內(nèi)隊x一5+細胞顯著增加切<0.05)，但其中eDZo表達未見增多，eDS一表達?

四川大學臨床醫(yī)學博士專業(yè)學位論文的祖B細胞，勃膜固有層內(nèi)漿細胞顯著減少勿<0.05)(圖2一2，表2一1)。正常對照三一討娜扮、卜于資片萬戶一-一，.啥廠磚一戶IIRPAX一5CD20CDS漿細胞圖2一2表2一1稱猴回腸PP內(nèi)B細胞表面標志物及漿細胞的變化(免疫組化，x4oo)稱猴回腸PP結(jié)內(nèi)CD20+、隊X一5+及固有膜內(nèi)漿細胞免疫組化半定量分析CD20PAX一5漿細胞面積(%)IOD面積(%)IOD面積(%)IOD正常 1IR 2.2士 1.6 3.2士 1.9462.6士329.1665.5士396.9 8.3土0.66352.2土 723.60.35士 0.22199.4士117.319.1士4.8*15210.1士5433.3*0.09士0.07*52.0士44.0*與正常比較，幼<0.05三、腸乳膜正常時，pp中TLR4、TLRZ、NF一KB、IFN一丫的表達pp中TLRZ、TLR4、NF一KB及IFN一丫表達均較弱，IIR時PP內(nèi)四種分子表達均明顯增強(圖2一3，表2一2)。
【參考文獻】

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本文編號：2889284