發(fā)布時(shí)間：2020-11-22 04:29

【摘要】：目的:HBV的感染一直是困擾人類的一個(gè)問(wèn)題,現(xiàn)有的手段并不能有效地控制其進(jìn)展,而近年來(lái)對(duì)RNA干擾的研究證明其在抗病毒方面也有著巨大的潛力。本實(shí)驗(yàn)擬評(píng)估長(zhǎng)的反義RNA干擾片段在培養(yǎng)細(xì)胞株中對(duì)HBV復(fù)制的抑制效應(yīng)。 方法:(1)將HBV基因組中S編碼基因的全部核苷酸序列插入至pTARGET載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒HBS2(反向插入序列)和HBS4(正向插入序列),并用這兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞。(2)實(shí)驗(yàn)分為HBS2組、HBS4組、干擾素組、聚肌胞組和對(duì)照組。(3)ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清中病毒抗原表達(dá)水平。(4)real time PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)和分泌入培養(yǎng)基的HBV DNA水平及細(xì)胞內(nèi)的HBV cccDNA水平。(5)real time RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)β-干擾素mRNA水平。(6)Cellular DNA Fragmentation ELISA測(cè)定各組細(xì)胞的凋亡率。 結(jié)果:(1)PCR及測(cè)序結(jié)果顯示HBS2和HBS4質(zhì)粒構(gòu)建成功。(2)ELISA結(jié)果顯示HBS2組、干擾素組、聚肌胞組細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg的水平較對(duì)照組降低(P0.05),HBS4組HBsAg水平較對(duì)照組升高(P0.05),HBeAg水平無(wú)變化(P0.05)。(3)real time PCR結(jié)果顯示HBS2組、干擾素組、聚肌胞組細(xì)胞上清中HBV DNA水平和細(xì)胞內(nèi)HBV DNA、HBV cccDNA水平較對(duì)照組降低(P0.05),HBS4組則均與對(duì)照組無(wú)差異(P0.05)。(4)real time RT-PCR結(jié)果顯示HBS2組、聚肌胞組細(xì)胞內(nèi)β-干擾素mRNA水平較對(duì)照組升高(P0.05),HBS4組與對(duì)照組無(wú)差異(P0.05)。(5)Cellular DNA Fragmentation ELISA結(jié)果顯示HBS2組、干擾素組和聚肌胞組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組升高(P0.05),HBS4組與對(duì)照組無(wú)差異(P0.05)。 結(jié)論:長(zhǎng)片段反義RNA能抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV基因的表達(dá)和病毒復(fù)制,且能誘導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R512.62
【圖文】：

12000rpm 離心 1min，棄去 溶液 W，12000rpm 離心 1min，棄心 3min，以徹底去除純化柱中殘柱置于新的離心管中，向純化柱中 2min。12000rpm 離心 1min。測(cè)濃A 為模板，PCR 擴(kuò)增 S 基因的編碼，重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò) PCR 擴(kuò)增后得到陽(yáng)序后得到重組質(zhì)粒 HBS2 和 HBS S 抗原。質(zhì)粒電泳圖見(jiàn)圖 1-1。1 2 3 4
【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 曲春花;周智;;慢性乙型肝炎抗病毒治療的困境和進(jìn)展[J];國(guó)際內(nèi)科學(xué)雜志;2008年02期

2 劉萍;叢國(guó)正;獨(dú)軍政;邵軍軍;林彤;�；菔|;;細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究進(jìn)展[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年03期

3 李再新,王慧;RNAi作用機(jī)制及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J];四川理工學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2005年03期

4 張嬌;劉倩;毛海婷;王杰;;干擾素對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15凋亡的影響[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年06期

5 張學(xué)智;山長(zhǎng)亮;葉麗虹;張曉東;;RNA干擾在抗乙肝治療中的應(yīng)用及其研究進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2008年06期

6 石華;宋方洲;;雙鏈RNA依賴性蛋白激酶的結(jié)構(gòu)與作用[J];生命的化學(xué);2006年01期

7 孔令波;佟立新;王錫育;;RNA干擾技術(shù)在抗乙型肝炎病毒感染應(yīng)用中的研究進(jìn)展[J];世界華人消化雜志;2009年13期

本文編號(hào)：2894122