發(fā)布時(shí)間：2024-06-30 18:55

　　目的目前,全球范圍內(nèi)肝臟疾病患者超過13億,其中10%-15%的慢性肝病患者在5-10年后會(huì)發(fā)生肝纖維化,并進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。我們前期結(jié)果表明人纖維化組織中乙醇脫氫酶I(ADHI)活性明顯升高,而異常激活的肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵,ADHI在HSC活化中的作用尚未見報(bào)道。方法本研究首先構(gòu)建ADHI真核表達(dá)載體,建立ADHI高表達(dá)及沉默的大鼠肝星狀細(xì)胞系(HSC-T6)模型。并分別用乙醇和非乙醇:LPS、TGF-β1進(jìn)行激活。通過Real-time PCR和Western-blot檢測ADHI的表達(dá)、纖維化指標(biāo)Ⅰ型膠原蛋白(COL1A1)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA) mRNA水平,分析外源性激活HSC-T6過程中ADHI的表達(dá),以及ADHI表達(dá)變化對有、無外源刺激HSC活化相關(guān)因子表達(dá)的影響。結(jié)果乙醇與非乙醇(TGF-β1、LPS)均促進(jìn)HSC-T6中ADHI的表達(dá)(P<0.05)。乙醇與非乙醇刺激ADHI高表達(dá)組后,COL1A1 mRNA水平明顯升高(P<0.01),α-SMA mRNA水平在24h明顯升高(P<0.001),48h無明...

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【部分圖文】：

圖1PEGFP-N1質(zhì)粒圖譜

.2ADHI真核表達(dá)載體構(gòu)建.2.1PCR特異性擴(kuò)增ADHI基因.2.1.1擴(kuò)增ADHI基因根據(jù)ADHI(GenBankAccession:NM_019286.4)基因以及PEGFP-N1質(zhì)粒多克隆酶切位點(diǎn)MCS（圖1），利用引物設(shè)計(jì)軟件CE....

圖2ADHI的PCR擴(kuò)增效率及特異性（1%的瓊脂糖凝膠電泳，M:DNAMaker10000bp；55～65℃：PCR的退火溫度梯度）

PCR擴(kuò)增效率及特異性（1%的瓊脂糖凝膠電泳，M:DNAMakCR的退火溫度梯度）P-ADHI真核表達(dá)載體的構(gòu)建因ADHI和pEGFP-N1質(zhì)粒分別經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶膠電泳純化（圖3）后，按照上述方法中的比例加入接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，鑒定....

圖3膠回收純化的凝膠電泳圖（M:10000bpDNAMaker；泳道1：pEGFP-N1質(zhì)粒；泳道2：目的基因ADHI）

約為1148bp，梯度（55℃-65℃）退火溫度下，ADHI的2）。PCR擴(kuò)增效率及特異性（1%的瓊脂糖凝膠電泳，M:DNAMaR的退火溫度梯度）P-ADHI真核表達(dá)載體的構(gòu)建因ADHI和pEGFP-N1質(zhì)粒分別經(jīng)EcoRI和HindIII雙膠電....

圖4重組質(zhì)粒的鑒定（M:10000bpDNAMaker；A：pEGFP-ADHI重組質(zhì)粒的連接效率，泳道1：pEGFP-N1質(zhì)粒；泳道2～9：pEGFP-ADHI質(zhì)粒；B：pEGFP-ADHI質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)

4重組質(zhì)粒的鑒定（M:10000bpDNAMaker；A：pEGFP-ADHI重組質(zhì)粒的連接效率道1：pEGFP-N1質(zhì)粒；泳道2~9：pEGFP-ADHI質(zhì)粒；B：pEGFP-ADHI質(zhì)粒雙酶切的鑒定，泳道1，2：pEGFP-ADHI質(zhì)粒）.3.2重組質(zhì)....

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