發(fā)布時(shí)間：2020-11-04 12:21

　　 目的失重或模擬失重條件下可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)氧自由基(ROS)產(chǎn)生增加,清除能力下降,導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能異常。內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能完整性對(duì)失重血管功能調(diào)節(jié)、防止動(dòng)脈硬化的發(fā)生至關(guān)重要,而microRNAs(miRNAs)廣泛參與了內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能重構(gòu)的調(diào)節(jié)。本研究通過(guò)細(xì)胞回轉(zhuǎn)模擬失重,探索EA.hy926細(xì)胞(HUVEC與肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的融合物)氧化應(yīng)激后差異表達(dá)的miRNAs及其意義。方法1.將EA.hy926細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶,將細(xì)胞分為對(duì)照組(C組)、對(duì)照氧化應(yīng)激組(C+H_2O_2組)、模擬失重組(Z組)和模擬失重后氧化應(yīng)激組(Z+H_2O_2組)四組。Z、Z+H_2O_2組裝滿細(xì)胞培養(yǎng)基,固定在細(xì)胞回轉(zhuǎn)器上,設(shè)定30轉(zhuǎn)/分37℃回轉(zhuǎn)培養(yǎng)72小時(shí);將C、C+H_2O_2組同樣灌滿培養(yǎng)液放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng);培養(yǎng)完畢后將所有細(xì)胞更換5ml/瓶新鮮培養(yǎng)液,用終濃度50mmol/L的過(guò)氧化氫刺激細(xì)胞C+H_2O_2、Z+H_2O_2組5小時(shí),然后收集細(xì)胞以備后續(xù)實(shí)驗(yàn);2.采用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)C、C+H_2O_2、Z和Z+H_2O_2四組細(xì)胞進(jìn)行miRNA測(cè)序,通過(guò)測(cè)序技術(shù)篩選不同組別間差異表達(dá)的miRNAs,采用相對(duì)定量法對(duì)各組別間共同差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證;3.對(duì)經(jīng)qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)與miRNA測(cè)序趨勢(shì)一致的差異miRNAs展開(kāi)生物信息學(xué)分析,通過(guò)生物信息學(xué)分析,了解差異表達(dá)miRNAs靶基因的顯著功能富集、顯著信號(hào)通路、蛋白互作關(guān)系;并對(duì)處于蛋白互作關(guān)系中的核心蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。結(jié)果通過(guò)顯著水平P0.05及差異倍數(shù)log2FC2或-2篩選差異表達(dá)miRNAs,C+H_2O_2 vs C有102個(gè)差異表達(dá)miRNAs,其中53個(gè)基因表達(dá)上調(diào),49個(gè)基因表達(dá)下調(diào);Z vs C中97個(gè)差異miRNSs(17個(gè)基因表達(dá)上調(diào),80個(gè)基因表達(dá)下調(diào));Z+H_2O_2 vs Z中71個(gè)差異miRNSs(52個(gè)基因表達(dá)上調(diào),19個(gè)基因表達(dá)下調(diào));Z+H_2O_2 vs C+H_2O_2中66個(gè)差異miRNSs(38個(gè)基因表達(dá)上調(diào),28個(gè)基因表達(dá)下調(diào))。RT-qPCR結(jié)果顯示,與C+H_2O_2組相比,Z+H_2O_2組hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-200c-3p表達(dá)增加,與miRNA測(cè)序結(jié)果一致。hsa-miR-29b-3p靶基因?yàn)镋RCC6、NFIA、TET3、BRWD3、FBN1、TET1、ATAD2B、RNF19A等,hsa-miR-200c-3p靶基因?yàn)锳POO、OSTM1、PAIP2、SULF1、KIAA1432、KDR、BAP1、DGKA、KLF4等。GO功能分析顯示二者富集于生物學(xué)粘附等生物過(guò)程,細(xì)胞連接等細(xì)胞組分、細(xì)胞結(jié)合等分子功能亞層。KEGG通路顯示hsa-miR-29b-3p靶基因顯著富集于局部黏附等信號(hào)通路,hsa-miR-200c-3p靶基因顯著富集于癌癥通路等信號(hào)通路。STRING蛋白互作分析結(jié)果表明hsa-miR-29b-3p靶基因中COL家族蛋白處于互作的關(guān)鍵位置,hsa-miR-200c-3p靶基因中RHOA處于互做的關(guān)鍵位置,經(jīng)Western blot驗(yàn)證核心蛋白R(shí)HOA,BCL-2在Z+H_2O_2 vs C中具有顯著表達(dá)趨勢(shì)。結(jié)論模擬失重下氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞包括hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-200c-3p在內(nèi)的miRNAs表達(dá)出現(xiàn)顯著差異,并通過(guò)對(duì)差異表達(dá)miRNAs靶基因及信號(hào)通路的調(diào)控參與失重條件下內(nèi)皮細(xì)胞生理功能的特異性調(diào)節(jié)。
【學(xué)位單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R85
【部分圖文】：

miRNA測(cè)序流程圖

miRNAs 與氧化應(yīng)激情況下失重環(huán)境對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡發(fā)生相關(guān)，后續(xù)將對(duì)其靶基因展開(kāi)生物信息分析。圖2 模擬失重和氧化應(yīng)激后EA.hy926細(xì)胞中hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-200c-3p表達(dá)變化注:*P<0.05, **P<0.01, ***表示P<0.001，n=12。討 論隨著科學(xué)研究中對(duì)低成本測(cè)序的高需求推動(dòng)了高通量第二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，因該技術(shù)使測(cè)序過(guò)程并行化，可同時(shí)產(chǎn)生數(shù)千或數(shù)百萬(wàn)個(gè)基因序列[24]。是研究miRNA對(duì)生物學(xué)影響的有力工具。但該技術(shù)還存在下述缺點(diǎn)：進(jìn)行堿基替換的步驟及讀取長(zhǎng)度在200bp-500bp的堿基長(zhǎng)度時(shí)易產(chǎn)生測(cè)序錯(cuò)誤，使測(cè)序結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性，降低了測(cè)序結(jié)果的可信度。熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度、特異度較高的優(yōu)點(diǎn)，其技術(shù)原理是通過(guò)熒光信號(hào)與目的產(chǎn)物拷貝數(shù)之間的關(guān)系計(jì)算基因的表達(dá)量，在本實(shí)驗(yàn)中可精確檢測(cè)miRNAs表達(dá)量。因此，本課題對(duì)經(jīng)miRNA測(cè)序篩選出的有意義的差異表達(dá)的miRNAs

圖3 miR-29b-3p、miR-200c-3p靶基因富集的生物過(guò)程（二）細(xì)胞組分（Cellular Component）miR-29b-3p 和 miR-200c-3p 差異基因功能富集分析分別得到到 8 個(gè)細(xì)胞組分亞層（圖 4）。這 2 個(gè) miRNAS 的差異表達(dá)基因均顯著富集于：細(xì)胞連接
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 許鵬;昝鄉(xiāng)鎮(zhèn);路德楊;饒永生;劉文斌;;疾病相關(guān)miRNAs識(shí)別方法研究進(jìn)展[J];廣州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2019年01期

2 穆尚強(qiáng);孫爽;王宇;梅繼文;;膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液miRNAs表達(dá)變化及意義[J];山東醫(yī)藥;2016年48期

3 丁瑩;雷小麗;孫旦;李玉琴;儲(chǔ)矗;陳正榮;季偉;周衛(wèi)芳;;肺炎支原體肺炎外周血miRNAs差異表達(dá)譜的篩選與驗(yàn)證[J];臨床兒科雜志;2017年02期

4 王閣;毛必靜;;miRNAs參與肝細(xì)胞肝癌發(fā)生機(jī)制的探索與臨床應(yīng)用的挑戰(zhàn)[J];世界華人消化雜志;2016年33期

5 MIAO Xiang-yang;;Recent advances in understanding the role of miRNAs in exosomes and their therapeutic potential[J];Journal of Integrative Agriculture;2017年04期

6 孫海霞;張洪欽;劉波泉;;支氣管哮喘患者血清相關(guān)miRNAs的檢測(cè)及其意義[J];中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2017年13期

7 徐坤;徐寶占;楊鐘會(huì);吳樹(shù)亮;初明;;miRNAs在脊髓損傷中作用的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年11期

8 黃振華;葉子;蔣鵬;肖孝勇;李茜;詹紅;;miRNAs在急性心肌梗死診斷中的研究進(jìn)展[J];嶺南心血管病雜志;2017年03期

9 田艷;冼樂(lè)武;韋伊爾;;吉非替尼誘導(dǎo)前后肺癌干細(xì)胞miRNAs的表達(dá)差異[J];廣東醫(yī)學(xué);2017年09期

10 楊倩;劉蘭心;黃荷鳳;;多囊卵巢綜合征患者卵泡液外泌體的提取鑒定及其miRNAs的提取和檢測(cè)[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2017年08期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李瑩;hAMSCs來(lái)源外泌體通過(guò)遞送miRNAs促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)的機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2019年

2 李小英;基于相似性網(wǎng)絡(luò)的疾病miRNAs預(yù)測(cè)方法研究及應(yīng)用[D];湖南大學(xué);2018年

3 栗振義;紫花苜蓿對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)及相關(guān)miRNAs的功能分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

4 苗楠;性別差異表達(dá)miRNAs在雞胚性腺發(fā)育早期的潛在功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

5 賈燕青;新城疫病毒感染雞胚miRNAs和mRNAs表達(dá)譜分析與抗病毒基因的篩選[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2018年

6 路艷芳;miRNAs在器官移植后免疫抑制患者HCMV感染中的致病機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2018年

7 王小敏;miRNAs介導(dǎo)的細(xì)胞自噬在豬圓環(huán)病毒2型復(fù)制中的作用及機(jī)制[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

8 袁海花;KHSRP的類(lèi)泛素化修飾下調(diào)一部分miRNAs的生成[D];上海交通大學(xué);2016年

9 饒家輝;RBP-4通過(guò)miRNAs影響豬卵泡顆粒細(xì)胞增殖的研究[D];吉林大學(xué);2019年

10 陳毅鵬;酒精性肝病特異性miRNAs表達(dá)譜及下游調(diào)控基因研究[D];浙江大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王亦文;TGF-β誘導(dǎo)H358細(xì)胞EMT過(guò)程中相關(guān)miRNAs表達(dá)的篩選及驗(yàn)證研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2019年

2 王依純;南方型紫花苜蓿耐鹽相關(guān)miRNAs分析及靶基因預(yù)測(cè)[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2019年

3 路玉盼;血根堿調(diào)控miRNAs及下游MAPK/JNK信號(hào)通路抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞增殖的作用及分子機(jī)制[D];山西中醫(yī)藥大學(xué);2018年

4 羅覓;不同倍性鯽鯉性腺發(fā)育相關(guān)基因和miRNAs的鑒定及功能分析[D];湖南師范大學(xué);2017年

5 劉佳;模擬失重下氧化應(yīng)激處理EA.hy926細(xì)胞miRNAs測(cè)序和生物信息學(xué)分析[D];錦州醫(yī)科大學(xué);2019年

6 從長(zhǎng)春;MiR-17-92基因簇及其部分miRNAs在椎管內(nèi)神經(jīng)鞘瘤中的表達(dá)和生物信息學(xué)分析[D];廈門(mén)大學(xué);2018年

7 李新;中等強(qiáng)度跑步對(duì)心率變異性和肌肉特異性miRNAs的影響[D];南京大學(xué);2019年

8 范現(xiàn)成;毒害艾美耳球蟲(chóng)感染雛雞小腸lncRNAs、miRNAs和CircRNAs表達(dá)譜分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

9 代寶珠;糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清miRNAs的表達(dá)及意義[D];西南醫(yī)科大學(xué);2019年

10 劉佳星;靶向?qū)ρ趿酌?的miRNAs的鑒定及其在非酒精性脂肪肝中的臨床應(yīng)用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2870093