發(fā)布時(shí)間：2018-11-08 10:13

【摘要】：活性氧(reactive oxygen species,ROS)存在于生物體的活細(xì)胞內(nèi),是由氧分子(O2)的不完全還原產(chǎn)生,包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(HO)和過氧化氫(H202)。ROS在細(xì)胞中會(huì)損傷脂類、蛋白和核苷酸。如在豆科植物與根瘤菌共生形成瘤體的過程中,豆科植物會(huì)產(chǎn)生ROS作為一種防御機(jī)制,此時(shí)根瘤菌會(huì)遭受到ROS的威脅。然而,這些ROS信號(hào)又能夠促進(jìn)結(jié)瘤因子的產(chǎn)生而且對(duì)瘤體的發(fā)育和固氮酶活性具有積極的作用。因此,根瘤菌如何應(yīng)對(duì)宿主產(chǎn)生的ROS是成功完成共生固氮的一個(gè)關(guān)鍵問題。已有研究發(fā)現(xiàn),過氧化氫酶(catalase)是清除無機(jī)過氧化物最主要的一類酶。田菁根瘤菌(Azorhizobium caulinodans ORS571)與毛萼田菁(Sesbania rostrata)形成的莖瘤,與根瘤相比,雖然面對(duì)更大的氧脅迫,但其固氮效率卻比根瘤高得多,因此研究田菁根瘤菌在共生固氮過程中如何應(yīng)對(duì)ROS是一個(gè)非常好的模型。通過生物信息學(xué)方法確定了田菁根瘤菌catalase相關(guān)基因katG(azc_3290)及其調(diào)控基因oxyR(azc_4162)。然后對(duì)katG和otyR基因進(jìn)行了框內(nèi)敲除。在體外條件下,測定WT、ΔkatG和ΔoxyR的生長曲線,結(jié)果發(fā)現(xiàn)katG和oxyR基因的敲除并不影響菌體的正常生長。為了檢測katG和oxyR基因的敲除對(duì)于其抗H202的影響,我們進(jìn)行了抑菌圈實(shí)驗(yàn)和殺菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與WT相比,ΔkatG對(duì)H2O2十分敏感,ΔoxyR對(duì)H202有一定的敏感性,沒有ΔkatG顯著,原因可能是OxyR是一個(gè)調(diào)控蛋白。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果,對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行了回復(fù)突變實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者在抗氧化能力方面都有部分回復(fù)。以上實(shí)驗(yàn)證明了katG和oxyR基因在田菁根瘤菌抗ROS方面發(fā)揮重要的作用。據(jù)報(bào)道,在許多其他細(xì)菌中都存在OxyR對(duì)catalase的調(diào)控作用,如大腸桿菌。因此,我們也研究了田菁根瘤菌中OxyR對(duì)katG的調(diào)控作用,通過構(gòu)建katG中間片段轉(zhuǎn)錄融合表達(dá)體系,在這個(gè)體系中報(bào)告基因lacZ是直接插入到田菁根瘤菌染色體的katG基因的中間位置,如此katG基因也被破壞。在WT和ΔoxyR菌株中檢測katG的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ΔoxyR中katG的表達(dá)量大幅度下降,而H202對(duì)于katG的表達(dá)沒有影響,這說明katG受OxyR正調(diào)控,但不受H2O2誘導(dǎo)。對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期都進(jìn)行了同樣的實(shí)驗(yàn),得到的結(jié)論基本一致。而且ΔoxyR回復(fù)突變株在katG的表達(dá)上具有部分回復(fù)作用。為了進(jìn)一步研究katG和oxyR基因在共生固氮過程中的作用。我們進(jìn)行了結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)和固氮酶活性測定實(shí)驗(yàn),對(duì)WT、ΔkatG和ΔotyR的結(jié)瘤能力和固氮酶活性進(jìn)行了測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)katG和oxyR基因的缺失會(huì)使田菁根瘤菌形成莖瘤的數(shù)量降低了 50%,同時(shí)固氮酶活性較WT相比降低了 60%。這說明katG和oxyR基因在共生固氮過程中具有十分重要的作用。由于katG和oxyR基因的缺失會(huì)影響其結(jié)瘤和固氮,因此對(duì)田菁根瘤菌中結(jié)瘤和固氮的關(guān)鍵基因nodA和nifA的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。我們構(gòu)建了nodA和nifA翻譯融合質(zhì)粒,在WT、ΔkatG和ΔoxyR菌株中檢測nodA和nifA表達(dá)。已知nodA基因的表達(dá)能夠被柚皮素誘導(dǎo),在有或無柚皮素、有或無H2O2的條件下檢測,發(fā)現(xiàn)nodA在WT、ΔkatG和ΔoxyR中的表達(dá)基本沒有太大差異,而H202對(duì)于nodA的表達(dá)也沒有太大影響;對(duì)于nifA來說,其在無氮培養(yǎng)基中會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá),在有或無氮培養(yǎng)基、有或無H202的條件下檢測,發(fā)現(xiàn)其在WT、ΔkatG和ΔoxyR中的表達(dá)也基本沒有太大差異,而H2O2對(duì)其表達(dá)沒有影響。總之,在本實(shí)驗(yàn)條件下katG和oxyR的敲除基本不影響nodA和nifA的表達(dá)。通過研究發(fā)現(xiàn),catalase相關(guān)基因katG在田菁根瘤菌共生固氮過程中發(fā)揮重要的作用,它的缺失直接影響到結(jié)瘤和固氮能力,并且在體外條件下受OxyR蛋白正調(diào)控,對(duì)于抵抗H202發(fā)揮著重要的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q939.114

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 ;Role of oxyR from Sinorhizobium meliloti in Regulating the Expression of Catalases[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2005年06期

2 陳丹明,曾昭海,隋新華,胡耀高,陳文新;紫花苜蓿高效共生根瘤菌的篩選[J];草業(yè)科學(xué);2002年06期

3 萬毅，，池建淮;絞股藍(lán)的研究與利用[J];安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1995年03期

4 劉昌玲,王國慶;細(xì)菌過氧化氫酶的分離、結(jié)晶及性質(zhì)[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1990年05期

本文編號(hào)：2318164