目的： 假性維生素D缺乏性佝僂病(pseudo-vitamin D-deficiency rickets, PDDR),是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病,系編碼25OHD31α羥化酶的CYP27B1基因突變所致,目前基因突變已發(fā)現(xiàn)近四十種,本組前期的研究首次在5名中國PDDR患者中發(fā)現(xiàn)了4個新突變,但這幾個突變對25OHD3Iα羥化酶的功能影響尚未證實。因此本實驗的主要目的是在構建CYP27B1體外過表達體系的基礎上,研究我組新發(fā)現(xiàn)的2個錯義突變G57V和L333F對25OHD3Iα羥化酶活性的影響,進而加深臨床醫(yī)生對于突變型和臨床表型關系的認識。 方法： 1.通過定點誘變將突變引入連接在質粒載體pCMVXL5上的CYP27BlcDNA,構建突變型CYP27B1基因G57V和L333F,并在體外大量擴增,得到大量的載有野生型和突變型基因的質粒DNA。 2.通過陽離子脂質體法轉染載有野生型和突變型基因的質粒至293T人胚腎細胞,構建CYP27B1野生型和突變型基因的體外過表達體系 3.轉染36小時后,向細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的底物250HD3,然后放入C02培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),使野生型和突變型酶在適當條件下進行體外羥化反應； 4.收集細胞培養(yǎng)液,經過提取和C18柱純化,用放免法對不同類型的細胞培養(yǎng)液進行250HD3和1,25(OH)2D3濃度的檢測,通過SPSS析因分析,比較突變型與野生型不同基因型之間是否存在顯著差異 5.收集完細胞培養(yǎng)液后將細胞提取總蛋白,通過western blot檢測驗證野生型和突變型的蛋白在體外是否有表達及表達水平是否一致。 結果： 1. CYP27B1野生型和突變型基因在293T細胞體外過表達體系中均有所表達,而且表達水平一致。 2.體外過表達的野生型和突變型CYP27B1均具酶活性,可以產生1,25(OH)2D3并被檢測到,突變型CYP27B1組1,25(OH)2D3水平顯著減低,其中G57V和L333F的酶活性分別為野生型的56.8%和70.75%。 結論：本實驗成功構建了1α羥化酶(CYP27B1)在293T人胚腎細胞中的體外過表達模型,并以此為基礎,對于在中國人群中首次發(fā)現(xiàn)的導致PDDR的兩個錯義突變進行了功能研究。結果顯示：突變型G57V和L333F的酶活性較野生型顯著減低,且與患者的臨床表型具有一定聯(lián)系。

【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R591.44
【目錄】：

【共引文獻】

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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2 盧靜;模擬空間環(huán)境誘導的氧化損傷、骨丟失抑制劑的篩選及G-B-R組合物的防護活性研究[D];哈爾濱工業(yè)大學;2013年

【相似文獻】

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