發(fā)布時間：2020-11-15 21:28

　　 半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)主要生長在我國近海地區(qū),是我國重要的海水經(jīng)濟(jì)繁育魚類。由于其肉質(zhì)鮮美滑嫩、營養(yǎng)價值高、生長速度快等特點而深受人們喜愛并且被廣泛養(yǎng)殖。隨著養(yǎng)殖數(shù)量的增多,病害的威脅也日趨嚴(yán)重,尤其是鰓、皮膚和腸道由哈維氏弧菌所引起的潰爛最為嚴(yán)重,給養(yǎng)殖業(yè)帶來的嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。同時,魚類主要的生存環(huán)境是在水體中,其中皮膚、鰓、腸等一些由大面積黏膜包被的組織是病原體侵入魚體時首先接觸的部位,因此黏膜不僅具有簡單的物理隔離作用,其局部黏膜的免疫防御作用對病原的侵入更加重要~([1])。由于魚類的系統(tǒng)進(jìn)化地位較低以及其自身具有的特性,魚類自身的獲得性免疫機(jī)制尚未完善,使得非特異性免疫在抵抗外來病原菌的過程中起到了比特異性免疫更重要的防御效用~([2])。因此,從分子免疫應(yīng)答方面來探究半滑舌鰨自身的免疫相關(guān)基因變得尤為緊迫。IgT是一種與硬骨魚類的IgM和IgD不同的新型的免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)基因,屬于Ig超家族成員之一。本實驗根據(jù)半滑舌鰨基因組數(shù)據(jù)庫對半滑舌鰨的新型的免疫球蛋白IgT序列的預(yù)測,通過PCR擴(kuò)增以及RACE方法得到了半滑舌鰨IgT基因cDNA全長2033 bp,開放閱讀框(ORF)1794 bp,編碼597個氨基酸,5’UTR為99 bp,3’UTR為140 bp。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示半滑舌鰨IgT氨基酸包含一個信號肽,4個重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(heavy chain domain,CH)和一個跨膜結(jié)構(gòu)域。經(jīng)CH區(qū)2蛋白序列的同源比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建,結(jié)果發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨IgT基因與牙鲆的IgT基因的進(jìn)化關(guān)系最近。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)結(jié)果顯示:IgT基因在半滑舌鰨鰓中的相對表達(dá)水平最高,在粘液、腸、脾臟和腎臟中的相對表達(dá)水平依次減少,在肌肉中的相對表達(dá)最低;經(jīng)哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)感染一定時間后,IgT基因在半滑舌鰨的6個免疫組織中都出現(xiàn)一定程度的上調(diào)趨勢,其中皮膚和肝臟在12 h出現(xiàn)峰值,腎臟在24 h出現(xiàn)峰值,在鰓和脾臟在48 h出現(xiàn)峰值,而腸到96 h時一直處于上調(diào)狀態(tài);在挑選出半滑舌鰨的抗病家系和易感家系中不同組織IgT基因的qRT-PCR結(jié)果顯示在抗病家系魚的脾臟、腸、鰓和粘液中的IgT基因的相對表達(dá)水平均高于易感家系,而腎臟和肝臟中IgT的表達(dá)水平在抗病家系和易感家系間則沒有明顯差別。根據(jù)這些實驗結(jié)果可以推測IgT基因在半滑舌鰨抵制外來病原菌的過程中起到了關(guān)鍵性的效用,并為魚類無損傷抗病力的評價、挑選抗病相關(guān)基因標(biāo)記、培養(yǎng)抗病良種和選育抗病家系提供了候選基因。多聚免疫球蛋白受體(polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)是I型跨膜糖蛋白,屬于Ig超家族的成員之一,以膜整合蛋白的形式作為多聚免疫球蛋白(pIgs)的介質(zhì),在黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行極性運轉(zhuǎn),在非特異性免疫與特異性免疫中均起到了重要效用~([3])。本實驗通過半滑舌鰨基因組數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的pIgR序列,經(jīng)過PCR擴(kuò)增以及RACE法方得到了半滑舌鰨pIgR cDNA全長為1419 bp,ORF為1020bp,編碼339個氨基酸,5’UTR區(qū)域為109 bp,3’UTR區(qū)域為290 bp。保守結(jié)構(gòu)域初步分析結(jié)果顯示半滑舌鰨的pIgR氨基酸序列含有一個信號肽、兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(Ig-like domain,ILD)、一個跨膜結(jié)構(gòu)域。通過蛋白同源比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨pIgR基因與大菱鲆和牙鲆的pIgR基因進(jìn)化關(guān)系最近。經(jīng)qRT-PCR實驗分析,發(fā)現(xiàn)pIgR在健康的半滑舌鰨中的9種組織里都有所表達(dá),且在鰓里pIgR相對表達(dá)水平最高,而在肌肉中相對表達(dá)最低。經(jīng)哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)感染刺激后,pIgR基因在半滑舌鰨的5個組織(肝臟、脾臟、腎臟、腸和鰓)中都出現(xiàn)先增加后減少的規(guī)律,其中在脾和鰓中48 h出現(xiàn)峰值,在肝、腎和腸中72 h達(dá)到峰值。與內(nèi)臟組織不同的是,pIgR基因在皮膚中呈一直上升的趨勢。這些實驗成果充分說明,pIgR在半滑舌鰨抵制哈維氏弧菌的反應(yīng)過程中起到了主要的效用。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文干透；（8）根據(jù)提取出小白點的大小情況，加入適量 RNase-Free 的超純水，將 RNA沉淀充分溶解；（9）用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA 質(zhì)量，可看見 28S、18S 兩個清楚的條帶（圖 2-1），表明提取的 RNA 結(jié)果良好可用于后續(xù)的實驗，同時使用 GeneQuantPro RNA/DNA 分光光度計測定 RNA 濃度；將合格的 RNA 放在﹣80 ℃保存?zhèn)溆谩?

圖 2-2 粘液 cDNA 的質(zhì)量檢測Fig.2-2 The detection of cDNA in Mucus2.3 半滑舌鰨 IgT 基因的克隆2.3.1 IgT 基因中間片段序列的驗證根據(jù) Chen 等完成的半滑舌鰨全基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果[15]，得到 IgT 的部分序列，設(shè)計了 2 對引物 IgT-F/R（表 2-1）驗證序列的正確性。設(shè)計的引物序列由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司（青島區(qū)）合成。表 2-1 實驗所用引物及目的Tab.2-1 The sequences and usageof primers used in this study引物引物序列(5ˊ-3ˊ)片段大小

24圖 2-4 半滑舌鰨 IgT 基因的 CH 區(qū)與其他物種 IgT的 CH 區(qū)多重序列比對結(jié)果Fig.2-4 The multiple sequence alignment of the IgT of CH in C.semilaevis with the IgT of CHin other species黑線表示的是形成鏈內(nèi)二硫鍵的保守半胱氨酸(C)殘基，保守色氨酸(W)殘基在序列下方顯示。形成與 Ig 輕鏈之間的鏈間二硫鍵放入保守半胱氨酸(C)殘基用“↑”標(biāo)記。The conserved cysteine (C) residues that form the intrachain disulfide bonds are marked withblacklines, and the conserved tryptophan (W) residues are shown below the sequences. Theconserved cysteine (C) residues that form the interchain disulfide bond with Ig L chain are markedby “↑”.
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本文編號：2885225