發(fā)布時間：2020-11-12 12:03

　　 核黃素可通過生物合成、代謝等多個環(huán)節(jié),尤其是黃素介導的氧化還原過程,影響植物防衛(wèi)和生長發(fā)育。異源表達中華鱉核黃素受體蛋白轉基因擬南芥體內內源核黃素含量高于野生型,同時轉基因植物也表現(xiàn)增強的抗病反應,但其機制不清楚。因此,本博士論文著重解析轉核黃素受體基因植物的抗病機制以及內源核黃素含量調控所影響的生理過程和代謝途徑,為闡明核黃素參與調控植物生長和防衛(wèi)反應的機制提供研究基礎。生物脅迫與非生物脅迫影響植物的正常生長與發(fā)育,植物對生物脅迫和非生物脅迫的響應稱為植物防衛(wèi)反應。本文的研究目標是鑒定參與調控植物防衛(wèi)反應中新的因子。 1.核黃素受體蛋白調控擬南芥過氧化氫(H2O2)信號及對病原細菌的防衛(wèi)反應 核黃素(維生素B2)在生物體內以黃素單核苷酸(flavin mononucleotide, FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)的形式作為輔基,與黃素蛋白(flavoprotein)或金屬黃素蛋白(metalloflavoprotein)組成復合酶,參與生物體內以氧化-還原反應為特征的五十多個生理生化過程。我們的研究表明,核黃素在擬南芥體內引發(fā)H2O2信號,調控對病原細菌的抗性。為了調控植物體內核黃素的含量,我們通過轉基因手段,在擬南芥過量表達中華鱉(Trionyx sinensis japonicus)的核黃素受體(riboflavin receptor)基因,得到轉基因擬南芥品系RIRA11 (riboflavin receptor expression Arabidopsis)。擬南芥轉基因植株(RIRA11)與野生型相比,在營養(yǎng)生長期間,體內核黃素含量增加、黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)含量降低,增強對病原細菌的抗性。轉錄組學分析表明,轉基因擬南芥(RIRA11)中涉及多個細胞進程的950個基因的表達發(fā)生了改變。其中線粒體電子傳遞有關的13個基因表達顯著下降,導致植株體內H2O2含量上升；RT-PCR和real-time PCR分析表明,此13個基因表達水平與芯片數(shù)據(jù)一致。轉基因植株中核黃素受體基因沉默后,其黃素含量和抗病表型回復到野生型的表型。我們的研究表明,通過調控增加植物體內黃素含量,抑制線粒體電子傳遞鏈基因表達,促進H2O2的產生,這些細胞生理代謝的變化,最后導致植物體內H2O2含量增加,增強植物抗病性。 2.外源核黃素受體蛋白調控擬南芥開花轉型 核黃素可通過生物合成、代謝等多個環(huán)節(jié),尤其是黃素介導的氧化還原過程,影響植物防衛(wèi)和生長發(fā)育。我們把中華鱉的核黃素受體基因轉入擬南芥中,借以調控植物體內的黃素含量,研究黃素對于植物防衛(wèi)與生長發(fā)育的調控作用。異源表達核黃素受體蛋白擬南芥品系RIRA11 (riboflavin receptor expression Arabidopsis)體內總的黃素含量增加,線粒體電子傳遞鏈主要基因轉錄水平下降,細胞氧化還原水平上升,開花提前。用RNAi方法沉默轉基因植株中的外源核黃素受體基因后,沉默植物恢復到野生型的表型。與野生型或基因沉默植株相比,過量表達核黃素受體擬南芥(RIRA11)開花轉型相關基因表達增強,頂端分生組織中開花標志基因AP1表達增強,開花提前。外源施用H202能誘導植物開花,但依賴于植株體內H2O2含量。我們的研究表明,過量表達核黃素受體擬南芥開花提前,H2O2在植物開花轉型過程中起重要作用。 3.晝夜節(jié)律調控擬南芥核黃素信號傳導反應 植物晝夜節(jié)律鐘在調控植物生理進程、對環(huán)境的響應和發(fā)育中起及其重要的作用。與此相似,核黃素信號途徑廣泛參與調控植物生長與發(fā)育。核黃素是黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前體。FMN, FAD是生物體黃素酶輔基,參與植物體內線粒體電子傳遞、光合作用、脂肪酸氧化、維生素B6、維生素B12、葉酸代謝等多個生化過程。本研究中,我們的研究結果表明,植物晝夜節(jié)律調控核黃素信號傳導途徑。我們通過異源表達中華鱉核黃素受體蛋白的擬南芥,來調控植物內源核黃素含量。異源表達核黃素受體擬南芥和野生型相似,內源核黃素含量在24 h周期內呈節(jié)律波動,但異源表達核黃素受體擬南芥植株內源核黃素含量顯著高于野生型植株。RT-PCR分析結果表明,植物內源核黃素含量升高影響了晝夜節(jié)律鐘輸入途徑和中心震蕩器有關基因的表達模式。另外,外源核黃素誘導或抑制基因的表達模式也受晝夜節(jié)律調控。外源核黃素施用植物能誘導植物產生防衛(wèi)反應,該過程也受晝夜節(jié)律調控。因此,我們的研究表明,植物晝夜節(jié)律鐘調控核黃素信號傳導反應。 4.擬南芥RIR類似蛋白(AtRIR)在非生物脅迫中的功能分析 滲透壓、氧和鹽等非生物脅迫影響植物的正常生長和發(fā)育。在非生物脅迫環(huán)境下植物體內產生、積累的活性氧對植物造成了氧脅迫。AtRIR (At5G27830)是一個功能未知蛋白,序列推測可能是核黃素受體(RIR)類似蛋白。RT-PCR和AtRIR啟動子控制的GUS活性檢測表明,AtRIR在植物所有主要器官包括根、莖、葉、花中表達。通過根長測定表明,與野生型擬南芥相比,AtRIR T-DNA插入突變體對滲透壓、氧和鹽脅迫更敏感；過量表達AtRIR轉基因擬南芥(AtRIR-OE)增強對滲透壓、氧脅迫的抗性。轉基因植株在鹽、氧、滲透壓脅迫和脫落酸處理下,與野生型相比,體內活性氧的含量降低,氧脅迫反應基因(APX1和FSD1)表達減弱；但非生物脅迫反應基因(COR47, RD29B, RD29A)表達增強。這些研究表明,AtRIR通過調控植物體內活性氧的含量,介導植物對非生物脅迫的抗性。 5.擬南芥RAP2.6L轉錄因子突變體增強對Pseudomonas syringae的抗性 植物受病原菌侵染或用病原物激發(fā)子處理植物時,激活的植物防衛(wèi)反應中涉及大量基因的轉錄調控。目前許多研究表明,ERF類轉錄因子在植物受病原物侵染后,通過調控寄主植物基因的表達參與植物防衛(wèi)反應。然而,特異的ERF轉錄因子在植物防衛(wèi)中的作用還知之甚少。我們分析了RAP2.6L轉錄因子在擬南芥對Pst DC3000基本防衛(wèi)中的作用。RAP2.6L偶聯(lián)GFP的融合蛋白在洋蔥表皮細胞中定位于細胞核。RAP2.6L受環(huán)境脅迫(水楊酸、茉莉酸、黃酮)的誘導表達。通過分析RAP2.6L在基本防衛(wèi)信號通路突變abi1-1, jar1-1, ein2-1和npr1-1上的受病原細菌誘導表達模式,表明水楊酸和茉莉酸信號通路正調控RAP2.6L表達,而乙烯信號通路抑制其表達。RAP2.6L T-DNA插入突變體rap2.6L接種Pst DC3000后,與野生型相比,3d后葉片細菌數(shù)量減少約10倍,病害癥狀顯著減輕,水楊酸調控的PR1, PR2基因表達增強�；�于rap2.6L突變體的分析表明,RAP2.6L負調控植物對Pst DC3000的基本防衛(wèi)反應。RAP2.6L具有轉錄激活功能,在植物防衛(wèi)反應中調控了許多下游因子,參與植物對病原細菌的抗性。 總結 本研究利用核黃素受體蛋白轉基因擬南芥為主要研究材料,對內源核黃素變化對于植物防衛(wèi)反應信號傳導機制及其開花轉型進行了解析。本文還對鑒定了調控擬南芥防衛(wèi)反應的兩個因子。研究發(fā)現(xiàn)：第一,核黃素受體轉基因擬南芥體內核黃素含量升高,轉錄組學分析影響了次級代謝、物質運輸、轉錄調控等多種生理代謝過程。核黃素通過抑制線粒體電子傳遞鏈基因表達,致使植株內源過氧化氫水平升高。第二,過氧化氫是擬南芥防衛(wèi)的重要信號分子,抑制植物過氧化氫含量同時也削弱了植物的防衛(wèi)能力。過氧化氫介導核黃素受體轉基因擬南芥對病原細菌的抗性。第三,核黃素受體蛋白轉基因擬南芥開花提前,過氧化氫在此過程中起重要作用,體外施用過氧化氫能誘導擬南芥提前開花。第四,野生型擬南芥葉片中核黃素含量受光周期調控,晝夜節(jié)律調控核黃素信號傳導。第五,鑒定了AtRIR在擬南芥抗非生物脅迫中的作用。第六,擬南芥RAP2.6L T-DNA突變體增強對病原細菌的抗性。
【學位單位】：南京農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：S432.1
【部分圖文】：

modifiedtranseriPtionalgenesProfile.(B)Overviewofthedifferentiallyalteredgenesencoding transcriPtionfaetors.對轉基因擬南芥RIRAll中表達顯著變化的基因作分類研究(圖1一3)，結果表明RIRAll中對線蟲反應 (responsetonematode)，對茉莉酸反應 (responsetojasmo垃 eaeidstimulate)

2.3轉基因擬南芥RIRA線粒體電子傳遞鏈基因表達受抑制，導致葉片過氧化氫(玩02)含量增加根據(jù)芯片數(shù)據(jù)(圖1一4A)，班RAn線粒體電子傳遞鏈下調的基因為13個(變化倍數(shù)蕊0.5)，另外有4個基因變化倍數(shù)在0.5一0.7之間。其中，位于復合體I上有四個，均為NADH一泛醒氧化還原酶相關基因;位于復合體111上有3個，為輔酶Q一細胞色素bcl還原酶基因;另外兩個分別為p產idine皿cleotide一 disulphideoxidoreductasefarnilyProtein和位于復合體W上的細胞色素氧化酶蛋白家族。而且，參與AfP合成的四個蛋白基因也被抑制。線粒體ETC的4種復合物中，復合體I和復合體111是產生ROS部位(Moller

受體蛋白(獄R)與RIR類似蛋白(AIRIR)以及轉錄因子RAp2.6L在擬南芥防衛(wèi)反應中的功能研究都有很強的與核黃素結合的生物活性(圖2一IC)，能顯著降低核黃素的熒光強度，核黃素中加入核黃素受體蛋白(RIR)后熒光值從 421.6降低到54.2(圖2一IC)，這表明我們在從中華鱉中克隆的核黃素受體蛋白是有結合核黃素的生物學功能。在擬南芥(Col一0)背景中用355啟動子過量表達中華鱉核黃素受體蛋白，得到轉基因品系RIRAll。Northem雜交 (RNAgelblot)表明，租RAll組成性過量表達核黃素受體基因(第1章)。為了明確轉基因植株的表型是由過量表達外源核黃素受體蛋白引起的，我們在轉基因品系RIRA背景中，轉入反向重復的核黃素受體基因片段單元，利用基因沉默(RNAI)的原理沉默mRA中外源的核黃素受體基因的表達。于是我們在RIRA背景中得到外源核黃素受體基因沉默植株，并命名位SIRn(園ence班RA旦)。從基因沉默植株SIRn提取的蛋白
【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 王麗萍;砧用南瓜提高黃瓜嫁接苗耐鹽性的生理機制及蛋白質組學研究[D];南京農業(yè)大學;2012年

相關碩士學位論文 前1條

1 田雙梅;轉錄因子AtMYB44促進擬南芥抗病耐熱及抑制開花的作用[D];南京農業(yè)大學;2012年

本文編號：2880724