發(fā)布時間：2020-06-13 00:54

【摘要】：棉花是我國重要的經(jīng)濟作物之一,也是世界第二大紡織纖維工業(yè)原料和食用油原料。隨著棉花基因工程和轉(zhuǎn)基因育種的不斷發(fā)展,轉(zhuǎn)基因育種成為棉花育種最為快捷高效的途徑。體細胞胚胎發(fā)生作為棉花再生體系的主要途徑,具有遺傳穩(wěn)定性好和嵌合體少的優(yōu)點,體細胞胚胎發(fā)生體系的建立是棉花高效遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的基礎。近年來,不同基因型棉花再生體系相繼建立,對棉花體細胞胚胎再生體系的分子機制研究也越來越多。其中,生長素和光在體細胞胚胎發(fā)生過程中對細胞命運的調(diào)控起著重要的作用,但生長素和光的相互作用網(wǎng)絡及對棉花組培是否有積極的影響還不清楚。本研究利用擬南芥體細胞胚胎發(fā)生體系,鑒定出了低通量的紅光對體細胞胚胎發(fā)生的胚性愈傷的建成具有正調(diào)控作用。通過不同光處理觀察,鑒定出最優(yōu)的光組合體系并通過DR5:GUS:GFP以及pPIN1:PIN1:GFP分析紅光和生長素的關系,并運用至棉花組培中,得到以下試驗結(jié)果:1.低通量的紅光影響擬南芥體胚發(fā)生的胚性愈傷的分化利用擬南芥體細胞胚胎發(fā)生(somatic embryogenesis,SE)體系來評價不同體細胞胚胎發(fā)生階段紅光的效果,初級體細胞胚(primary somatic embryo,PSE)誘導和胚性愈傷(disc-like embryonic calli,EC)誘導階段采用不同組合的光照,觀察并分別計算了EC誘導5天時的細胞分化率。結(jié)果表明在白光條件下誘導PSEs,紅光條件下進行胚性愈傷誘導為最優(yōu)體系,其與黑暗相比,紅光處理下的EC誘導率明顯提高。2.紅光通過促進胚性愈傷誘導過程中生長素的積累和分布誘導胚性愈傷建成白光條件下初級體細胞胚胎被誘導,胚性愈傷誘導分別在黑暗和紅光條件下誘導的體系被用來進行該項研究。利用擬南芥DR5:GUS:GFP和pPIN1:PIN1:GFP轉(zhuǎn)基因材料來監(jiān)測胚性愈傷誘導階段不同光處理下的生長素的含量及其分布情況。結(jié)果表明,在胚性愈傷誘導階段2-5天,相較于黑暗,紅光處理下的GFP和GUS的表達更明顯且分布更為廣泛。這說明紅光通過促進生長素的合成和分布促進胚性愈傷的建成。3.低通量紅光應用于棉花體細胞胚胎發(fā)生為了明確低通量紅光對棉花體細胞胚胎分化的影響,將低通量紅光設置在棉花體細胞胚胎發(fā)生的體系中進行研究,結(jié)果表明,相較于對照(16h白光/8h黑暗),紅光(16h紅光/8h黑暗)作用于棉花體細胞胚胎發(fā)生中的愈傷誘導階段將很大程度提高胚性愈傷的分化效率。利用DR5:GFP轉(zhuǎn)基因棉花材料證明了紅光通過促進生長素的積累來加速胚性愈傷的建成,并且紅光對難分化材料中12的分化具有明顯的改善。這說明,紅光可應用于棉花組培優(yōu)化體細胞胚胎發(fā)生體系進而輔助棉花遺傳轉(zhuǎn)化。綜上所述,低通量的紅光能夠顯著提高棉花胚性愈傷的誘導分化和改善難分化材料愈傷組織的誘導,且與生長素的積累分布密切相關。打破了由棉花愈傷組織向胚性愈傷分化效率低的瓶頸,為棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)應用于品種選育奠定了基礎。
【圖文】：

3 結(jié)果與分析 擬南芥和棉花體細胞胚胎發(fā)生的形態(tài)學觀察分析 擬南芥體細胞胚胎發(fā)生形態(tài)學觀察為了確立一個高效擬南芥體細胞胚胎發(fā)生體系，本研究采用了蘇英華等改體系。剪取在擬南芥室培養(yǎng)至 5-6 周的擬南芥彎子葉胚（未成熟的合子胚植體（圖 1A），首先在初級胚誘導培養(yǎng)基上全光照條件下誘導初級胚，接，在苗端分生組織觀察到綠色的初級體細胞胚（圖 1B）。將初級胚轉(zhuǎn)入更,4-D 的液體培養(yǎng)基中在懸浮培養(yǎng)繼續(xù)誘導，培養(yǎng) 14 天后圓盤狀的胚性愈傷（圖 1C）。之后將胚性愈傷轉(zhuǎn)入不含激素的液體培養(yǎng)基中（B5 基礎培養(yǎng)基浮條件下繼續(xù)培養(yǎng)，當培養(yǎng) 3-4 天時，子葉原基已經(jīng)形成，其形態(tài)和心形似，子葉原基之間形成莖尖分生組織（Stem apex meristem, SAM）（圖 1D培養(yǎng)至 8 天時，從胚性愈傷中誘導出具有胚軸、兩個明顯的子葉和莖尖分次級胚（圖 1E）。

隨著誘導天數(shù)的增加，愈傷的狀態(tài)由早期愈傷（圖2C）逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹笃谟鷤麪顟B(tài)（圖 2D），后期愈傷狀態(tài)蓬松，含水量豐富。將愈傷轉(zhuǎn)移到胚性愈傷組織分化培養(yǎng)基（embryogenic callus induce medium, ECIM）上來誘導胚性愈傷（ECs）的形成。在 ECIM 上培養(yǎng)一段時間后，會誘導出大量米粒狀的ECs（圖 2-E）。接著將胚性愈傷轉(zhuǎn)移到體細胞胚誘導培養(yǎng)基（embryo induce medium,EIM）上誘導體細胞胚（SEs）的形成，根據(jù)體細胞胚發(fā)育狀態(tài)的不同，將體細胞胚分為球形胚（圖 2F）、心形胚（圖 2G）、魚雷胚（圖 2H）和子葉胚（圖 2I）。
【學位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S562

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