發(fā)布時間：2024-06-29 13:15

　　植物為了抵御非生物逆境脅迫造成的傷害,體內(nèi)會產(chǎn)生各種應對的作用機制,其中,泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)是最重要的機制之一。干旱是最常見的非生物逆境,嚴重危害小麥的產(chǎn)量。本研究在前期克隆小麥干旱脅迫響應基因TaDIS1及功能初步分析的基礎上,通過酵母雙雜交技術(shù)篩選TaDIS1的互作蛋白及體內(nèi)、外驗證,并對其互作蛋白進行初步功能分析,最后通過體外泛素化實驗和降解實驗解析其作用機理。取得以下研究結(jié)果:1.通過酵母雙雜實驗篩選出TaDIS1的8個潛在互作蛋白,其中TaSTP是其互作蛋白之一,根據(jù)序列比對及結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明該蛋白是一種逆境蛋白,可能與ABA調(diào)控途徑有關(guān)。TaSTP基因全長為887bp,包含89bp的5’UTR區(qū)、462bp的ORF和336bp的3’UTR區(qū)。2.為了排除酵母雙雜交實驗可能出現(xiàn)的假陽性,我們通過BiFC,Pull-Down,CoIP實驗對TaDIS1與TaSTP的互作關(guān)系進行驗證。在BiFC實驗中,發(fā)現(xiàn)TaDIS1和TaSTP在煙草葉片細胞的某一內(nèi)含體發(fā)出熒光,表明TaDIS1和TaSTP在細胞內(nèi)部互作;Pull-Down實驗結(jié)果表明,TaDIS1在體外可以被TaSTP...

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號對照表
第一章 文獻綜述
    1.1 植物響應干旱脅迫的研究現(xiàn)狀
        1.1.1 干旱脅迫對植物的影響
        1.1.2 植物響應干旱脅迫的研究進展
    1.2 泛素/26S蛋白酶體途徑的研究現(xiàn)狀
        1.2.1 泛素化過程
        1.2.2 E3泛素連接酶的種類
    1.3 泛素/26S蛋白酶體途徑在逆境脅迫中的研究現(xiàn)狀
        1.3.1 泛素/26S蛋白酶體途徑在植物應對逆境脅迫中的作用
        1.3.2 E3泛素連接酶的研究現(xiàn)狀
    1.4 酵母雙雜交篩庫系統(tǒng)進展
        1.4.1 酵母雙雜交篩庫的原理
        1.4.2 酵母雙雜交篩庫技術(shù)的優(yōu)缺點
        1.4.3 酵母雙雜交篩庫技術(shù)研究現(xiàn)狀
    1.5 雙分子熒光互補實驗進展
        1.5.1 雙分子熒光互補實驗的原理
        1.5.2 雙分子熒光互補實驗的優(yōu)缺點
        1.5.3 雙分子熒光互補實驗的研究現(xiàn)狀
    1.6 GST Pull-Down實驗進展
        1.6.1 GST Pull-Down技術(shù)的原理
        1.6.2 GST Pull-Down技術(shù)的優(yōu)缺點
        1.6.3 GST Pull-Down技術(shù)的研究現(xiàn)狀
    1.7 免疫共沉淀實驗進展
        1.7.1 免疫共沉淀技術(shù)的原理
        1.7.2 免疫共沉淀技術(shù)的優(yōu)缺點
        1.7.3 免疫共沉淀技術(shù)的研究現(xiàn)狀
    1.8 體外泛素化實驗進展
        1.8.1 體外泛素化實驗原理
        1.8.2 體外泛素化實驗研究現(xiàn)狀
    1.9 26S蛋白酶體降解途徑實驗進展
    1.10 熒光定量實驗進展
    1.11 本研究的目的意義及技術(shù)路線
        1.11.1 目的意義
        1.11.2 技術(shù)路線
第二章 小麥TaDIS1互作蛋白的篩選及鑒定
    2.1 實驗材料
        2.1.1 質(zhì)粒和菌株
        2.1.2 主要試劑和配方
    2.2 實驗方法
        2.2.1 誘餌載體pGBKT7 載體的構(gòu)建
        2.2.2 將文庫質(zhì)粒導入Y187 菌株
        2.2.3 從中國春的c DNA文庫篩選互作蛋白
        2.2.4 將篩選出的互作蛋白進行回轉(zhuǎn)驗證
    2.3 實驗結(jié)果與分析
        2.3.1 自激活和毒性驗證的結(jié)果與分析
        2.3.2 初步篩選出的互作蛋白的結(jié)果與分析
        2.3.3 回轉(zhuǎn)驗證的結(jié)果與分析
    2.4 討論
第三章 Ta DIS1與TaSTP互作關(guān)系的驗證
    3.1 實驗材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株,質(zhì)粒和試劑
    3.2 實驗方法
        3.2.1 引物的設計
        3.2.2 載體的構(gòu)建
        3.2.3 BiFC實驗和亞細胞定位實驗
        3.2.4 Pull-Down實驗
        3.2.5 CoIP實驗
    3.3 實驗結(jié)果與分析
        3.3.1 TaDIS1與TaSTP的定位情況
        3.3.2 TaDIS1與TaSTP的共定位分析
        3.3.3 蛋白的原核表達結(jié)果及分析
        3.3.4 體外互作驗證的結(jié)果與分析
        3.3.5 體內(nèi)互作驗證的結(jié)果與分析
    3.4 討論
第四章 TaDIS1的酶活分析及其底物蛋白的驗證
    4.1 實驗材料
        4.1.1 質(zhì)粒和菌株
        4.1.2 主要試劑和配方
    4.2 實驗方法
        4.2.1 定點突變的引物設計
        4.2.2 進行定點突變
        4.2.3 載體構(gòu)建
        4.2.4 進行體外泛素化實驗
        4.2.5 進行降解實驗
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 TaDIS1 和突變的酶活驗證
        4.3.2 底物蛋白的驗證與分析
    4.4 討論
第五章 TaSTP對逆境脅迫下的表達分析
    5.1 實驗材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 試劑
    5.2 實驗方法
        5.2.1 熒光定量引物的設計
        5.2.2 小麥材料的的處理
        5.2.3 小麥RNA的提取
        5.2.4 cDNA的合成
        5.2.5 進行qRT-PCR反應
    5.3 實驗結(jié)果與分析
        5.3.1 RNA的質(zhì)量檢測
        5.3.2 TaSTP的表達模式分析
    5.4 討論
第六章 結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡介



本文編號：3997609