發(fā)布時間：2020-11-12 07:01

　　 種子成熟是一個特異、復雜的發(fā)育過程,不僅是決定種子質量和產量的關鍵時期,也是影響種子貯藏質量的重要環(huán)節(jié)。然而目前人們對種子成熟調控機制的認識還相對薄弱。LncRNA是一類長度大于200nt、無編碼蛋白能力的RNA,近些年的研究表明它們在真核生物中種類豐富且分布廣泛,能夠在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平調控基因的表達或直接影響蛋白功能。目前人們對植物lncRNAs的功能及作用機理有了一定的認識,它們在許多生物過程中均發(fā)揮著重要的作用,然而尚未見到lncRNA在種子成熟中的功能及其作用機制方面的報道。本研究利用實驗室建立的種子成熟調控因子鑒定體系,從種子貯藏蛋白的角度鑒定了介導種子成熟調控的lncRNAs并對其作用機理進行了初步探索,主要研究結果如下:1.收集擬南芥4個發(fā)育時期(4、7、12、17 DAP)的種子,經高通量檢測及生物信息學分析共得到64個響應種子成熟的lncRNAs候選基因,其中24個為上調基因,40個為下調基因;24個lncRNAs位于基因轉錄模塊區(qū)域,35個為基因間lncRNAs,5個為反義lncRNAs。2.挑選了9個lncRNAs進行了基因克隆并構建到表達載體中,利用蘸花侵染將6個上調表達的lncRNAs轉化入gus23(種子成熟報告基因體系),3個下調表達的lncRNAs轉化入野生型擬南芥,獲得轉基因純合體后用于隨后研究。3.通過GUS染色方法對6個轉入gus23的基因是否參與種子成熟調控進行了初步分析,結果表明lncRNA-Seed9和lncRNA-Seed53可以導致gus23幼苗真葉出現GUS表型,暗示種子貯藏蛋白基因SSPs在這2個lncRNA過表達幼苗中異位表達。隨后qPCR結果表明種子成熟調控因子LEC2與貯藏蛋白2S2基因在lncRNA-Seed53過表達幼苗中的表達量顯著高于野生型。進一步對種子成熟主要調控因子在lncRNA-Seed53過表達植株種子中的表達情況進行了檢測,結果表明在lncRNA-Seed53過表達植株7 DAP的果莢中LEC2基因有著較小幅度的上調表達;而在12 DAP的果莢中LEC1基因的表達量顯著提高。這些結果表明lncRNA-Seed53是一個種子成熟的調控因子。4.對轉基因植株種子及其它方面的表型進行了分析,結果表明lncRNA-Seed53過表達植株果莢短且飽滿、果莢生長緩慢、種子大等表型,此外在幼苗期具有葉柄短、蓮座葉圓且較小、早花、花苞緊湊且花瓣變短等表型。同時,我們也觀察到lncRNA-Seed26過表達的種子萌芽受到抑制,并且植株具有萌芽晚,幼苗植株小的表型。5.為闡釋lncRNA-Seed26和lncRNA-Seed53的調控機制進行了準備和初步探索。1)利用qPCR對2個lncRNAs的相鄰基因表達情況進行了分析,結果表明lncRNA-Seed53可以抑制KIP1基因的表達;在lncRNA-Seed26過表達幼苗中TPPI基因的表達量提高,LRR基因的表達降低。2)為了深入研究這些lncRNAs的功能,我們針對lncRNA-Seed26和lncRNA-Seed53分別設計了兩個gRNA靶點,構建了雙gRNA靶點saCas9/gRNA載體,并進行了擬南芥轉化。經篩選鑒定得到7株lncRNA-Seed26-CRISPR突變體植株,saCas9/gRNA載體編輯效率為2.083%;及3株lncRNA-Seed53-CRISPR突變體植株,saCas9/gRNA載體編輯效率為0.704%。3)我們通過生物信息學分析及重疊延伸PCR構建了35S:S1streptavidin-tagged lncRNA-Seed26載體,并篩選鑒定出T_1代S1-lncRNA-Seed26轉基因植株,這為了鑒定該lncRNA的靶標基因奠定了基礎。這些研究結果拓展了人們對種子成熟調控網絡的認識及對植物lncRNA生物學功能的理解,為深入展開這些lncRNAs的調控機制研究奠定了基礎。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

圖 1.1 植物種子成熟調控網絡與植物 lncRNA 的生物學功能Fig.1.1 Regulation network of seed maturation and the known lncRNA-mediatedprocesses1.2.4 植物 lncRNA 的作用機制許多 lncRNAs 的作用機制已在哺乳動物[51-55]中得到了闡釋，并且很多研究表明 lncRNAs 與人類研究發(fā)育[56]、胚胎發(fā)育[57]、生殖細胞發(fā)育[58]以及人類疾病之間有著密切的聯系[59-64]。然而在植物中只有很少 lncRNAs 的作用機理得到了闡釋，可以歸納為以下幾個方面：1）通過“目標模仿”（eTM）機制抑制 miRNA 的活性，進而調控基因的表達。最為經典的例子就是擬南芥 lncRNA-AtIPS1 可以模仿 miR399 的靶標PHO2，與 PHO2，競爭結合 miR399，從而促使 PHO2 的轉錄積累[65]。王秀杰實驗室在擬南芥和水稻中分別鑒定了 36 和 189 個 eTMs，說明 lncRNAs 作為 eTM

研究方案與技術路線簡圖

2.1.1 植物材料擬南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia 型，gus23（由加拿大農業(yè)部倫敦研究與開發(fā)中心崔玉海研究員實驗室惠贈）。植株均培養(yǎng)于吉林大學和平校區(qū)邊少敏教授所屬培養(yǎng)室，根據實驗需求不同，種植在草炭土與蛭石 3:1 的基質或MS 培養(yǎng)基中。2.1.2 菌株及載體由上海麥琪公司購買大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 感受態(tài)細胞及農桿菌 GV3101 感受態(tài)細胞；用于 Gateway 載體構建技術中的入門載體 pDONR207由中國科學院植物研究所劉永秀研究員惠贈；植物載體、農桿菌雙元表達載體pEarleyGate 100（含有 Bar 基因）由加拿大農業(yè)部倫敦研究與開發(fā)中心崔玉海研究員實驗室惠贈，如圖 2.1 所示。A B
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本文編號：2880425