發(fā)布時(shí)間：2020-12-12 05:46

　　在植物的基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯對(duì)農(nóng)作物的遺傳改良具有重要意義。目前,CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其簡(jiǎn)便性和高效性已被廣泛應(yīng)用于包含馬鈴薯在內(nèi)的多種作物的基因組編輯。然而,由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅能識(shí)別PAM序列為5’-NGG-3’的前導(dǎo)序列,極大限制了其定點(diǎn)編輯的適用范圍,因此如何擴(kuò)展CRISPR系統(tǒng)的編輯范圍是目前基因編輯領(lǐng)域一個(gè)重要的研究方向。CRISPR/Cpf1是一類新型CRISPR系統(tǒng),其可特異識(shí)別PAM序列為5’-TTTN-3’后面的24 bp,這極大豐富了CRISPR系統(tǒng)對(duì)靶標(biāo)位點(diǎn)的選擇范圍,因而其也成為繼CRISPR/Cas9系統(tǒng)后又一研究熱點(diǎn)。然而CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在茄科作物中的研究還不是很深入,在馬鈴薯中的應(yīng)用就未見(jiàn)報(bào)道,因此本論文擬針對(duì)CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在馬鈴薯中的應(yīng)用進(jìn)行系統(tǒng)的研究。首先,本論文根據(jù)前人的研究基礎(chǔ),分別對(duì)Cpf1蛋白的兩個(gè)變體LbCpf1和AsCpf1進(jìn)行了基于雙子葉植物的密碼子優(yōu)化,然后針對(duì)CrRNA的表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建了4套優(yōu)化表達(dá)體系:核酸酶介導(dǎo)的RIBO系統(tǒng),基于Cys4的CrRNA切除的Csy4系統(tǒng),多順?lè)醋覴NA表達(dá)的... 

【文章來(lái)源】：云南師范大學(xué)云南省

【文章頁(yè)數(shù)】：58 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

a圖為AsCpf1的晶體結(jié)構(gòu)圖

圖 2.2 CIP-65 材料基因組的全長(zhǎng)以及靶點(diǎn)示意圖在靶點(diǎn)的一個(gè) 5'端添加上 ATTG,在其反向互補(bǔ)的 5'端加上 AAAC。B位點(diǎn)合成引物，2 個(gè)靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)了 4 條 sgRNA 的引物：StCDF1 sp1-F：ATTGGATTCATGATCCAAATGAAGStCDF1 sp1-R：AAACCTTCATTTGGATCATGAATCStCDF1 sp2-F：AGCGATGACATCAAGATGCStCDF1 sp2-R: GCATCTTGATGTCATCGCT將兩個(gè)引物做退火體系如表(2.3)sgRNA引物退火體系表 2.3成分 加入量tCDF1 sp1/sp2-F (100 μM） 3μLStCDF1 sp1/sp2-R (100 μM) 3μL10xNEB buffer3.1 10μL超純水 88 μLtotal 100 μL

第二章 載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建酶切連接體系放在 PCR 儀中：37℃條件下 10 h；50℃條件下 5 m 10 min。取 10 μL 連接產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，經(jīng)過(guò)菌篩后StCDF1/PKSE402 -SP1 載體與 StCDF1/PKSE402 –SP2。2.3 CRISPR/AS-Cpf1 與 CRISPR/LB-Cpf1 的載體組裝 CPF1 蛋白與其他載體元件大片段的合成 們 將 Acidaminococcus sp. BV3L6Cpf1(AsCpf1) 與 Lachnosum ND2006(LbCpf1)的 Cpf1 序列做了植物性密碼子優(yōu)化，并在公的合成：示意圖如下：2.3 與 2.4


本文編號(hào)：2911965