發(fā)布時(shí)間：2020-12-16 23:44

　　酶解木聚糖是生物制備木寡糖（益生元）的主要方法之一。然而,由于主鏈與側(cè)鏈交聯(lián)形成的網(wǎng)絡(luò)化結(jié)構(gòu),致使木聚糖需要復(fù)雜的多酶協(xié)同催化才可實(shí)現(xiàn)有效降解。因此,挖掘兼?zhèn)浣到饽揪厶侵麈満蛡?cè)鏈的雙功能酶具有重要意義。本研究利用基因挖掘策略獲得了雙功能乙酰酯-木糖苷水解酶（CLH10）。CLH10的氨基酸序列包含離散的保守酯酶序列片段和保守糖苷酶序列片段,系單序列結(jié)構(gòu)域雙功能酶。晶體結(jié)構(gòu)揭示CLH10的氨基酸序列折疊形成了一個(gè)球形蛋白分子,該分子的兩個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)區(qū)域分別承擔(dān)了其對(duì)于乙酰酯和木糖苷類底物的識(shí)別催化能力。因此,CLH10具備“一酶多用”作用于木聚糖主鏈和側(cè)鏈高效酶解乙酰化木聚糖分子,進(jìn)而制備木寡糖的應(yīng)用潛力。值得注意的是,CLH10是一個(gè)保守的酯酶分子,其β-1,4-木糖苷鍵水解活力的獲得機(jī)制為,基于酯酶結(jié)構(gòu)骨架的Loop結(jié)構(gòu)區(qū)域偶然獲得了糖苷鍵水解關(guān)鍵殘基對(duì)（Asp10\Glu139）,且靈活的Loop結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了對(duì)于木糖苷底物的有效識(shí)別。上述發(fā)現(xiàn)提示,以酶分子的Loop區(qū)域作為定向進(jìn)化或理性設(shè)計(jì)靶向區(qū)域可成為拓展酶催化功能的潛在研究焦點(diǎn)。 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：73 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1. 緒論
    1.1 引言
    1.2 糖苷水解酶
        1.2.1 糖苷水解酶的定義及催化機(jī)制
        1.2.2 β-1,4木糖苷鍵水解酶
    1.3 碳水化合物酯酶
        1.3.1 碳水化合物酯酶的定義及催化機(jī)制
        1.3.2 阿魏酸酯酶
    1.4 木聚糖的協(xié)同酶解
    1.5 雙功能酶的底物識(shí)別和催化機(jī)制
    1.6 雙功能乙酰酯-木糖苷水解酶的分類
    1.7 酶的理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化
    1.8 本研究工作思路
2. 材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)工作部分
        2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和試劑
        2.1.2 載體構(gòu)建和蛋白表達(dá)
        2.1.3 蛋白純化
        2.1.4 晶體制備及優(yōu)化
        2.1.5 晶體衍射
        2.1.6 定點(diǎn)突變
        2.1.7 酶活力檢測(cè)
    2.2 計(jì)算工作方法
        2.2.1 序列挖掘
        2.2.2 氨基酸序列保守性分析
        2.2.3 晶體結(jié)構(gòu)解析
        2.2.4 虛擬飽和突變文庫(kù)構(gòu)建
        2.2.5 分子對(duì)接
        2.2.6 分子動(dòng)力學(xué)模擬
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論
    3.1 目的基因挖掘
    3.2 目的蛋白表達(dá)純化
    3.3 目的蛋白晶體優(yōu)化及結(jié)構(gòu)解析
    3.4 酶學(xué)性質(zhì)表征
    3.5 底物識(shí)別及催化機(jī)制
    3.6 雙催化功能行為關(guān)系
    3.7 雙催化功能形成機(jī)制
4. 總結(jié)及展望
參考文獻(xiàn)
個(gè)人主要學(xué)術(shù)成果
致謝



本文編號(hào)：2921002