山核桃GH3家族基因的功能初步研究及其在嫁接過程中的表達(dá)分析
發(fā)布時(shí)間：2024-07-02 01:29
山核桃(Carya cathayensis Sarg.)為胡桃科(Juglandaceae)山核桃屬(Carya Nutt.)的木本油料樹種,是浙江西北部、安徽南部地區(qū)的特色經(jīng)濟(jì)樹種,經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。嫁接技術(shù)的應(yīng)用能有效縮短山核桃童期,矮化樹體,同時(shí)有利于實(shí)現(xiàn)山核桃良種化栽培。早期研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素含量的動(dòng)態(tài)變化在嫁接愈合過程中發(fā)揮著重要作用,GH3基因參與植物生長(zhǎng)素穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié),但CcGH3基因調(diào)控山核桃嫁接成活的機(jī)理未見報(bào)道。本研究主要以山核桃嫁接苗為實(shí)驗(yàn)材料,克隆并分析了山核桃GH3家族基因的序列特征和表達(dá)模式;分析了CcGH3家族基因啟動(dòng)子順式作用元件,并驗(yàn)證了CcGH3-1基因啟動(dòng)子誘導(dǎo)活性;通過異源轉(zhuǎn)化擬南芥,初步驗(yàn)證了CcGH3基因的基本功能;分析了CcGH3家族基因在山核桃嫁接過程中的表達(dá)模式。主要研究結(jié)果如下:(1)共克隆獲得了12個(gè)山核桃GH3基因全長(zhǎng)CDS序列;CcGH3家族蛋白有較高的保守性,尤其是ATP/AMP依賴的�；钚晕稽c(diǎn),暗示該家族有較強(qiáng)的腺苷化及氨基化酶學(xué)活性;CcGH3蛋白與木本植物中的同源蛋白有更近的親緣關(guān)系;除GH3-x外,其他CcGH3蛋白均定位于細(xì)...
【文章頁數(shù)】：101 頁
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【文章目錄】：
摘要
Abstract
本文縮略詞
引言
1 文獻(xiàn)綜述
1.1 嫁接概述與山核桃嫁接研究進(jìn)展
1.1.1 植物嫁接概述
1.1.2 山核桃嫁接研究進(jìn)展
1.1.3 生長(zhǎng)素對(duì)嫁接的影響
1.2 植物GH3基因研究進(jìn)展
1.2.1 GH3基因的分類
1.2.2 GH3蛋白的結(jié)構(gòu)
1.2.3 GH3基因的功能與調(diào)控
1.2.3.1 GH3基因參與生長(zhǎng)素的穩(wěn)態(tài)調(diào)控
1.2.3.2 GH3基因參與植物的脅迫響應(yīng)
1.2.3.3 GH3基因的表達(dá)調(diào)控
1.3 本研究的目的與意義
2 山核桃GH3基因的克隆和生物信息學(xué)分析
2.1 材料與方法
2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1.1 植物材料
2.1.1.2 試劑和儀器
2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1.2.1 山核桃葉片總RNA提取
3.1.2.2 RACE cDNA的合成
2.1.2.3 山核桃GH3基因搜索及引物設(shè)計(jì)
2.1.2.4 GH3基因全長(zhǎng)擴(kuò)增
2.1.2.5 3’端GH3基因擴(kuò)增
2.1.2.6 克隆片段的載體連接
2.1.2.7 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)
2.1.2.8 菌檢和測(cè)序
2.1.2.9 山核桃GH3基因生物信息學(xué)分析
2.2 結(jié)果與分析
2.2.1 山核桃葉片總RNA的提取
2.2.2 山核桃GH3基因克隆
2.2.2.1 基因末端克隆
2.2.2.2 基因全長(zhǎng)克隆
2.2.3 山核桃GH3基因序列分析
2.2.3.1 山核桃GH3蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析
2.2.3.2 山核桃GH3蛋白的同源性及進(jìn)化分析
2.3 討論
2.4 小結(jié)
3 山核桃GH3基因的表達(dá)模式分析
3.1 材料與方法
3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理
3.1.1.1 植物材料
3.1.1.2 試劑和儀器
3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
3.1.2.1 山核桃不同組織及激素誘導(dǎo)葉片的總RNA提取
3.1.2.2 cDNA的合成
3.1.2.3 定量引物設(shè)計(jì)
3.1.2.4 熒光定量PCR
3.1.2.5 數(shù)據(jù)處理
3.2 結(jié)果與分析
3.2.1 山核桃不同組織器官的總RNA
3.2.2 激素誘導(dǎo)山核桃葉片RNA提取
3.2.3 山核桃GH3基因在不同組織中的表達(dá)
3.2.4 不同植物激素對(duì)山核桃GH3基因的誘導(dǎo)
3.3 討論
3.4 小結(jié)
4 山核桃GH3家族基因啟動(dòng)子分析
4.1 材料與方法
4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
4.1.1.1 植物材料
4.1.1.2 試劑和儀器
4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
4.1.2.1 山核桃葉片DNA提取
4.1.2.2 啟動(dòng)子的搜索及引物設(shè)計(jì)
4.1.2.3 啟動(dòng)子片段克隆
4.1.2.4 CcGH3p::GUS載體構(gòu)建
4.1.2.5 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)
4.1.2.6 農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片
4.1.2.7 GUS組織化學(xué)染色
4.1.2.8 熒光法測(cè)定GUS酶活性
4.2 結(jié)果與分析
4.2.1 CcGH3-1啟動(dòng)子克隆與分析
4.2.1.1 CcGH3-1啟動(dòng)子序列克隆
4.2.1.2 CcGH3-1基因啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析
4.2.2 山核桃GH3家族啟動(dòng)子激素相關(guān)順式作用元件鑒定
4.2.3 CcGH3-1啟動(dòng)子活性分析
4.2.3.1 不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子CcGH3-1p::GUS表達(dá)載體構(gòu)建
4.2.3.2 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
4.2.3.3 4-MU熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
4.2.3.4 不同長(zhǎng)度CcGH3-1啟動(dòng)子的GUS酶表達(dá)活性
4.2.3.5 植物激素誘導(dǎo)下CcGH3-1啟動(dòng)子的GUS酶表達(dá)活性
4.3 討論
4.4 小結(jié)
5 山核桃GH3-1和CcGH3-6a在擬南芥中功能驗(yàn)證
5.1 材料與方法
5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
5.1.1.1 植物材料
5.1.1.2 試劑及儀器
5.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
5.1.2.1 擬南芥的種植與培養(yǎng)
5.1.2.2 35S::CcGH3:GFP載體構(gòu)建
5.1.2.3 轉(zhuǎn)化擬南芥
5.1.2.4 過表達(dá)擬南芥抗性篩選
5.1.2.5 過表達(dá)擬南芥的PCR鑒定與熒光觀察
5.1.2.6 過表達(dá)擬南芥中生長(zhǎng)素代謝通路基因的表達(dá)分析
5.2 結(jié)果與分析
5.2.1 35S::CcGH3:GFP過表達(dá)載體構(gòu)建
5.2.1.1 35S::CcGH3-1:GFP表達(dá)載體構(gòu)建
5.2.1.2 35S::CcGH3-6a:GFP表達(dá)載體構(gòu)建
5.2.2 過表達(dá)CcGH3擬南芥植株的鑒定
5.2.3 過表達(dá)CcGH3擬南芥植株的表型分析
5.2.4 生長(zhǎng)素代謝通路基因在擬南芥過表達(dá)株系中的表達(dá)變化
5.2.4.1 過表達(dá)CcGH3擬南芥中AtGH3基因的表達(dá)
5.2.4.2 過表達(dá)CcGH3擬南芥中AtILL基因的表達(dá)
5.2.4.3 過表達(dá)CcGH3擬南芥中AtPIN和 AtAUX1/LAX基因的表達(dá)
5.2.4.4 過表達(dá)CcGH3擬南芥中AtYUC基因的表達(dá)
5.3 討論
5.4 小結(jié)
6 山核桃GH3家族基因在嫁接愈合過程中的表達(dá)變化
6.1 材料與方法
6.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
6.1.1.1 山核桃嫁接苗
6.1.1.2 試劑及儀器
6.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
6.1.2.1 嫁接山核桃砧木和接穗部位總RNA提取
6.1.2.2 cDNA的合成
6.1.2.3 定量引物設(shè)計(jì)
6.1.2.4 熒光定量PCR及數(shù)據(jù)分析
6.1.2.5 游離IAA含量的測(cè)定
6.2 結(jié)果與分析
6.2.1 山核桃嫁接部位總RNA的提取
6.2.2 CcGH3基因在山核桃嫁接過程中的表達(dá)分析
6.2.2.1 CcGH3基因在嫁接過程中的表達(dá)
6.2.2.2 嫁接過程中激素對(duì)CcGH3基因表達(dá)的影響
6.2.3 嫁接過程中游離IAA的含量變化分析
6.2.3.1 IAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線與方程
6.2.3.2 嫁接部位IAA的含量變化
6.3 討論
6.4 小結(jié)
7 結(jié)論與展望
7.1 結(jié)論
7.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
Ⅰ 常用試劑配方
Ⅱ 擬南芥、楊樹、巨桉GH3基因的登錄號(hào)
Ⅲ 擬南芥定量引物序列
個(gè)人簡(jiǎn)介
致謝
本文編號(hào)：3999487
【文章頁數(shù)】：101 頁
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【文章目錄】：
摘要
Abstract
本文縮略詞
引言
1 文獻(xiàn)綜述
1.1 嫁接概述與山核桃嫁接研究進(jìn)展
1.1.1 植物嫁接概述
1.1.2 山核桃嫁接研究進(jìn)展
1.1.3 生長(zhǎng)素對(duì)嫁接的影響
1.2 植物GH3基因研究進(jìn)展
1.2.1 GH3基因的分類
1.2.2 GH3蛋白的結(jié)構(gòu)
1.2.3 GH3基因的功能與調(diào)控
1.2.3.1 GH3基因參與生長(zhǎng)素的穩(wěn)態(tài)調(diào)控
1.2.3.2 GH3基因參與植物的脅迫響應(yīng)
1.2.3.3 GH3基因的表達(dá)調(diào)控
1.3 本研究的目的與意義
2 山核桃GH3基因的克隆和生物信息學(xué)分析
2.1 材料與方法
2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1.1 植物材料
2.1.1.2 試劑和儀器
2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1.2.1 山核桃葉片總RNA提取
3.1.2.2 RACE cDNA的合成
2.1.2.3 山核桃GH3基因搜索及引物設(shè)計(jì)
2.1.2.4 GH3基因全長(zhǎng)擴(kuò)增
2.1.2.5 3’端GH3基因擴(kuò)增
2.1.2.6 克隆片段的載體連接
2.1.2.7 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)
2.1.2.8 菌檢和測(cè)序
2.1.2.9 山核桃GH3基因生物信息學(xué)分析
2.2 結(jié)果與分析
2.2.1 山核桃葉片總RNA的提取
2.2.2 山核桃GH3基因克隆
2.2.2.1 基因末端克隆
2.2.2.2 基因全長(zhǎng)克隆
2.2.3 山核桃GH3基因序列分析
2.2.3.1 山核桃GH3蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析
2.2.3.2 山核桃GH3蛋白的同源性及進(jìn)化分析
2.3 討論
2.4 小結(jié)
3 山核桃GH3基因的表達(dá)模式分析
3.1 材料與方法
3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理
3.1.1.1 植物材料
3.1.1.2 試劑和儀器
3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
3.1.2.1 山核桃不同組織及激素誘導(dǎo)葉片的總RNA提取
3.1.2.2 cDNA的合成
3.1.2.3 定量引物設(shè)計(jì)
3.1.2.4 熒光定量PCR
3.1.2.5 數(shù)據(jù)處理
3.2 結(jié)果與分析
3.2.1 山核桃不同組織器官的總RNA
3.2.2 激素誘導(dǎo)山核桃葉片RNA提取
3.2.3 山核桃GH3基因在不同組織中的表達(dá)
3.2.4 不同植物激素對(duì)山核桃GH3基因的誘導(dǎo)
3.3 討論
3.4 小結(jié)
4 山核桃GH3家族基因啟動(dòng)子分析
4.1 材料與方法
4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
4.1.1.1 植物材料
4.1.1.2 試劑和儀器
4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
4.1.2.1 山核桃葉片DNA提取
4.1.2.2 啟動(dòng)子的搜索及引物設(shè)計(jì)
4.1.2.3 啟動(dòng)子片段克隆
4.1.2.4 CcGH3p::GUS載體構(gòu)建
4.1.2.5 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)
4.1.2.6 農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片
4.1.2.7 GUS組織化學(xué)染色
4.1.2.8 熒光法測(cè)定GUS酶活性
4.2 結(jié)果與分析
4.2.1 CcGH3-1啟動(dòng)子克隆與分析
4.2.1.1 CcGH3-1啟動(dòng)子序列克隆
4.2.1.2 CcGH3-1基因啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析
4.2.2 山核桃GH3家族啟動(dòng)子激素相關(guān)順式作用元件鑒定
4.2.3 CcGH3-1啟動(dòng)子活性分析
4.2.3.1 不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子CcGH3-1p::GUS表達(dá)載體構(gòu)建
4.2.3.2 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
4.2.3.3 4-MU熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
4.2.3.4 不同長(zhǎng)度CcGH3-1啟動(dòng)子的GUS酶表達(dá)活性
4.2.3.5 植物激素誘導(dǎo)下CcGH3-1啟動(dòng)子的GUS酶表達(dá)活性
4.3 討論
4.4 小結(jié)
5 山核桃GH3-1和CcGH3-6a在擬南芥中功能驗(yàn)證
5.1 材料與方法
5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
5.1.1.1 植物材料
5.1.1.2 試劑及儀器
5.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
5.1.2.1 擬南芥的種植與培養(yǎng)
5.1.2.2 35S::CcGH3:GFP載體構(gòu)建
5.1.2.3 轉(zhuǎn)化擬南芥
5.1.2.4 過表達(dá)擬南芥抗性篩選
5.1.2.5 過表達(dá)擬南芥的PCR鑒定與熒光觀察
5.1.2.6 過表達(dá)擬南芥中生長(zhǎng)素代謝通路基因的表達(dá)分析
5.2 結(jié)果與分析
5.2.1 35S::CcGH3:GFP過表達(dá)載體構(gòu)建
5.2.1.1 35S::CcGH3-1:GFP表達(dá)載體構(gòu)建
5.2.1.2 35S::CcGH3-6a:GFP表達(dá)載體構(gòu)建
5.2.2 過表達(dá)CcGH3擬南芥植株的鑒定
5.2.3 過表達(dá)CcGH3擬南芥植株的表型分析
5.2.4 生長(zhǎng)素代謝通路基因在擬南芥過表達(dá)株系中的表達(dá)變化
5.2.4.1 過表達(dá)CcGH3擬南芥中AtGH3基因的表達(dá)
5.2.4.2 過表達(dá)CcGH3擬南芥中AtILL基因的表達(dá)
5.2.4.3 過表達(dá)CcGH3擬南芥中AtPIN和 AtAUX1/LAX基因的表達(dá)
5.2.4.4 過表達(dá)CcGH3擬南芥中AtYUC基因的表達(dá)
5.3 討論
5.4 小結(jié)
6 山核桃GH3家族基因在嫁接愈合過程中的表達(dá)變化
6.1 材料與方法
6.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
6.1.1.1 山核桃嫁接苗
6.1.1.2 試劑及儀器
6.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
6.1.2.1 嫁接山核桃砧木和接穗部位總RNA提取
6.1.2.2 cDNA的合成
6.1.2.3 定量引物設(shè)計(jì)
6.1.2.4 熒光定量PCR及數(shù)據(jù)分析
6.1.2.5 游離IAA含量的測(cè)定
6.2 結(jié)果與分析
6.2.1 山核桃嫁接部位總RNA的提取
6.2.2 CcGH3基因在山核桃嫁接過程中的表達(dá)分析
6.2.2.1 CcGH3基因在嫁接過程中的表達(dá)
6.2.2.2 嫁接過程中激素對(duì)CcGH3基因表達(dá)的影響
6.2.3 嫁接過程中游離IAA的含量變化分析
6.2.3.1 IAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線與方程
6.2.3.2 嫁接部位IAA的含量變化
6.3 討論
6.4 小結(jié)
7 結(jié)論與展望
7.1 結(jié)論
7.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
Ⅰ 常用試劑配方
Ⅱ 擬南芥、楊樹、巨桉GH3基因的登錄號(hào)
Ⅲ 擬南芥定量引物序列
個(gè)人簡(jiǎn)介
致謝
本文編號(hào)：3999487
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