發(fā)布時間：2024-07-05 02:49

　　為了簡化純化步驟,節(jié)約生產成本,筆者構建了能夠胞外分泌鼠羧肽酶原B(proCPB)的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-OmpA-proCPB,并進行發(fā)酵優(yōu)化。結果表明:在信號肽OmpA的引導下,proCPB成功分泌至胞外,激活后的羧肽酶B(carboxypeptidase B,CPB)比酶活為131.22 U/mg。通過單因素及正交試驗對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化,得出最佳培養(yǎng)基組合為甘油7 g/L、復合氮源15 g/L、MgSO₄ 4 mmol/L、山梨醇0.3 mol/L、NaCl 10 g/L;最佳發(fā)酵條件為誘導溫度30℃,誘導時間24 h。優(yōu)化后,胞外proCPB的相對表達量為6.35(優(yōu)化前的相對表達量為1)。首次實現了鼠羧肽酶原B在大腸桿菌中的胞外分泌表達,為羧肽酶B的工業(yè)化直接應用提供了一定的技術支持。

【文章頁數】：9 頁

【部分圖文】：

圖1重組表達質粒pET28a-OmpA-proCPB雙酶切驗證

2.1重組表達質粒的構建將構建得到的重組表達質粒pET28a-OmpA-proCPB用EcoRⅠ和HindⅢ酶切驗證,結果如圖1所示。由圖1可見,大小為5724和1313bp的條帶,分別與pET28a線性化載體和OmpA-proCPB-6*His融合片段大小一致,且測序結....

圖2重組菌BL21(DE3)/pET28a-OmpA-proCPB

將重組菌BL21(DE3)/pET28a-OmpA-proCPB進行搖瓶發(fā)酵,誘導表達30h后取發(fā)酵液進行離心,所得上清液即為粗酶液。經鎳柱分離純化,并使用SDS-PAGE進行分析,結果如圖2所示。由圖2可知,條帶2為單一條帶,大小約為4.6×104,條帶大小與重組蛋白理論分子....

圖3胰蛋白酶最佳酶解時間的確定

羧肽酶原B是羧肽酶B的酶原形式,胰蛋白酶通過在Arg95處切除前導肽可將羧肽酶原B激活,得到有活性的羧肽酶B。胰蛋白酶的酶解條件對羧肽酶B的酶活性至關重要。筆者在1∶50質量比的條件下,對胰蛋白酶的酶解時間進行優(yōu)化,發(fā)現酶解時間過短,羧肽酶原B不能被完全酶解,只能得到部分羧肽酶....

圖4純化后CPB的SDS-PAGE

透析后的proCPB酶液經胰蛋白酶酶解2h后,立即加入0.1mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)終止反應,并進行鎳柱分離純化,對洗脫液進行SDS-PAGE分析,結果如圖4所示。由圖4可知,通過試驗得到單一目的條帶,大小約為3.5×104,經測定比酶活為131.22U/mg....

本文編號：4000927