發(fā)布時(shí)間：2020-03-26 08:11

【摘要】：有機(jī)磷農(nóng)藥以其高效、廉價(jià)等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用,但其對(duì)人體健康和環(huán)境等影響較大是不容忽視的問題。目前國內(nèi)外已報(bào)道的甲基對(duì)硫磷降解菌有假單胞菌(Pseudomonas sp.)、黃桿菌(Flavobacterium sp.)、產(chǎn)堿菌(Alcaligenes sp.)和節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)等;毒死蜱降解菌有阿氏腸桿菌(Enterobacter asburiae)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)和玫瑰紅紅球菌(Rhodocouus rhodochrous)等。但是已報(bào)道的細(xì)菌由于環(huán)境適應(yīng)性不強(qiáng)等原因,還未達(dá)到開發(fā)利用的要求,因此仍需篩選更加高效的專性或兼性降解菌。另外,有關(guān)同一菌種的不同菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解差異性也鮮有報(bào)道。本研究旨在尋找高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株,明確菌株的分類學(xué)地位,同時(shí)探討環(huán)境條件對(duì)菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥的影響、單株菌的降解動(dòng)力學(xué)和降解混合菌的構(gòu)建。進(jìn)一步提取降解酶,優(yōu)化產(chǎn)酶條件,明確降解酶的酶促降解特性,進(jìn)而研究?jī)?yōu)勢(shì)菌株的固定化條件和特性。研究結(jié)果如下: 1.采用直接分離與富集馴化培養(yǎng)相結(jié)合的方法,分離篩選出三株能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株HY-1、HY-2和HY-4,在形態(tài)特征和生理生化分析的基礎(chǔ)上,又對(duì)其16S rDNA序列進(jìn)行了分析,并研究了其對(duì)甲基對(duì)硫磷(Methyl-parathion)、毒死蜱(Chlorpyrifos)和三唑磷(Triazophos)的降解特性。結(jié)果表明:三菌株為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)的不同菌株,三菌株在Genbank上的登錄號(hào)分別為:eu915687、eu915686和eu915688。三菌株在72 h內(nèi)對(duì)初始濃度為50 mg/L甲基對(duì)硫磷的降解率分別達(dá)到91.7%、88.7%與92.4%,菌株之間無顯著性差異(P0.05);在毒死蜱初始濃度為50 mg/L和100 mg/L時(shí),HY-1和HY-4降解毒死蜱的能力和HY-2有顯著性差異(P0.05),其中三菌株在72 h內(nèi)對(duì)100 mg/L毒死蜱的降解率分別達(dá)到64.8%、53.7%和59.5%;三菌株在72 h內(nèi)對(duì)初始濃度為100 mg/L三唑磷的降解率分布在13.3% 20.7%之間,其中HY-2對(duì)三唑磷的降解率較高,并和其余兩菌株有顯著性差異(P0.05)。可以看出,蠟狀芽孢桿菌的不同菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解存在差異性。 2.以單因素試驗(yàn)探討了三菌株降解甲基對(duì)硫磷和毒死蜱的影響因素,得出了三菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥的最適環(huán)境條件。結(jié)果表明:菌株HY-2能夠利用甲基對(duì)硫磷和毒死蜱為唯一磷源降解農(nóng)藥。HY-2降解甲基對(duì)硫磷的適宜條件為:培養(yǎng)溫度30°C 35°C、初始pH為6 8、甲基對(duì)硫磷初始濃度為10 50 mg/L、接種量20%(體積比,菌體密度:稀釋到菌懸母液(OD600=3.0)的0.8倍),添加葡萄糖不能促進(jìn)菌株對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解;HY-2降解毒死蜱的適宜條件為:葡萄糖濃度6 g/L、培養(yǎng)溫度30°C 35°C、初始pH為7、毒死蜱初始濃度為80 200 mg/L、接種量20%(體積比,菌體密度:稀釋到菌懸母液(OD600=3.0)的0.8倍)。HY-1和HY-4兩菌株降解毒死蜱的適宜條件為:葡萄糖濃度3 g/L、培養(yǎng)溫度35°C、初始pH為7 8、毒死蜱初始濃度80 mg/L、接種量20%(體積比,菌體密度:稀釋到所配菌懸母液(OD600=2)的0.5倍)。酵母膏含量對(duì)毒死蜱的降解影響表明,當(dāng)添加3 g/L的葡萄糖時(shí),最適的酵母膏含量為1 g/L,而不添加葡萄糖時(shí),最適的酵母膏含量為5 g/L。在酵母膏試驗(yàn)濃度范圍之內(nèi),不添加葡萄糖時(shí)菌株對(duì)毒死蜱的降解率最終也不能達(dá)到含有葡萄糖的水平。 3.采用種子液培養(yǎng)基中定量添加毒死蜱和定時(shí)取樣分析毒死蜱殘留濃度的方法,明確了毒死蜱對(duì)蠟狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)抑制動(dòng)力學(xué)和菌株對(duì)毒死蜱的降解動(dòng)力學(xué),同時(shí)研究了降解菌對(duì)高濃度毒死蜱的耐受度和菌膠團(tuán)的形成能力。結(jié)果表明:HY-1、HY-2和HY-4三菌株最適種子液培養(yǎng)時(shí)間分別為10、19和15 h。含毒死蜱培養(yǎng)液和空白對(duì)照相比,HY-1和HY-2兩菌株生長(zhǎng)的適應(yīng)期延長(zhǎng),對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期順序后延。隨著培養(yǎng)液中菌體數(shù)量的增長(zhǎng),培養(yǎng)液的pH也隨之升高。接菌量為8%(V/V)時(shí)降解率最高。HY-1和HY-2兩菌株對(duì)不同濃度的毒死蜱表現(xiàn)出不同的降解規(guī)律。對(duì)于低濃度的毒死蜱,毒死蜱的濃度隨著時(shí)間的推移而下降;當(dāng)毒死蜱濃度較高時(shí),毒死蜱的降解過程包括吸附、解吸和降解等幾個(gè)階段。一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程ln(C0/Ct) = kt可以用來擬合毒死蜱的降解動(dòng)力學(xué)及確定降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn),菌株HY-2比HY-1可以耐受更高的毒死蜱濃度,但HY-1的菌膠團(tuán)形成能力要高于HY-2。 4.為明確蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)混合菌株對(duì)毒死蜱的降解效果,本研究采用正交試驗(yàn)的方法構(gòu)建混合菌。以混合菌對(duì)毒死蜱的降解率和菌株的生長(zhǎng)量為依據(jù),利用單一因素試驗(yàn)考察了不同因素對(duì)混合菌降解毒死蜱的影響。兩菌株組合時(shí)研究發(fā)現(xiàn),HY-1和HY-4兩菌株的比例為1:1(V/V)時(shí),對(duì)80 mg/L毒死蜱的降解率最高。添加葡萄糖有助于菌株的生長(zhǎng),但是不利于毒死蜱的降解。偏堿性環(huán)境對(duì)菌株的生長(zhǎng)有利,對(duì)毒死蜱的降解也有利。菌株的降解動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn),兩菌株混合對(duì)毒死蜱的降解和單菌的降解規(guī)律相似。兩菌株混合時(shí)能夠耐受20 70 g/L的NaCl濃度,且對(duì)80 mg/L毒死蜱的降解率都在41%以上。利用正交試驗(yàn)構(gòu)建的三菌株組合降解混合菌的體積比為:1:1:3。在含80 mg/L毒死蜱的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,接菌量為8%(V/V)時(shí)降解率最高,降解最適pH值為7。在試驗(yàn)濃度下,三菌株混合菌對(duì)毒死蜱的降解也符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程�；旌暇鷮�(duì)高鹽具有很高的耐受度,當(dāng)反應(yīng)液中NaCl濃度在20 100 g/L之間時(shí),三菌株混合菌對(duì)80 mg/L毒死蜱的降解率仍較高,最高達(dá)61%。 5.以從蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)HY-1菌株中提取到的降解酶比活力為指標(biāo),進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化研究。通過單一因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),對(duì)菌株HY-1的產(chǎn)酶培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。運(yùn)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析,所獲優(yōu)化培養(yǎng)基配方為:葡萄糖6.0 g/L、胰蛋白胨2.2 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、KH2PO4 0.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、NaCl 0.1 g/L和微量元素溶液2 mL/L。菌株發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)化條件為:種子液培養(yǎng)時(shí)間16 h、發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間18 h、接種量1%(V/V)、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為7.0。在NaCl濃度為0?30 g/L時(shí),所產(chǎn)降解酶比活力不受影響。這是已報(bào)道的耐鹽性最強(qiáng)的一株毒死蜱降解菌。 6.為明確毒死蜱降解菌-蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)HY-1的粗酶液對(duì)毒死蜱的降解特性,采用測(cè)定粗酶比活力的方法,研究了不同環(huán)境因素對(duì)粗酶液降解毒死蜱的影響。結(jié)果表明:粗酶液中可溶性蛋白的含量為2.21 g/L,測(cè)得粗提酶其米氏常數(shù)Km為1.2356 mmol/L,最大降解速率Vmax為0.0226μmol/(mg·min)。酶促反應(yīng)時(shí)間為1 h時(shí),粗酶液對(duì)50 mg/L毒死蜱的降解率最高可達(dá)74%,粗酶液加入量為1 mL時(shí)的比活力最高。在20°C ?44°C的溫度范圍內(nèi),粗酶液都能保持較好的降解活性,其中最適溫度為28°C;在pH 5?9之間時(shí),粗酶比活力都能達(dá)最高比活力的66%以上,最適pH為6。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),該粗提酶具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性,在溫度為-20°C ?40°C,pH為4?8的條件下,暴露1 h仍能保持較高的比活力。該粗酶液在10?70 g/L的NaCl濃度下保持1 h仍能高效降解毒死蜱。該降解粗酶與國內(nèi)外已報(bào)道的毒死蜱降解粗酶相比,其耐鹽性是最高的,故進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用價(jià)值較大。 7.以海藻酸鈉為載體,采用注射器滴定方法將蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)HY-1用海藻酸鈉溶膠包埋,研究固定化菌對(duì)毒死蜱的降解效果。結(jié)果表明:海藻酸鈉固定化菌能高效降解基礎(chǔ)培養(yǎng)基中100 mg/L的毒死蜱。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為60 h時(shí),固定化菌對(duì)100 mg/L毒死蜱的降解率最大。固定化菌顆粒接入量為160 g/L時(shí),其對(duì)100 mg/L毒死蜱的降解率最高。固定化菌對(duì)毒死蜱的降解有著較寬泛的pH適應(yīng)范圍,在pH 5 10時(shí)都能高效降解毒死蜱。當(dāng)毒死蜱初始濃度為80 mg/L和100 mg/L時(shí),固定化菌對(duì)毒死蜱的降解率較高,達(dá)90%左右。固定化菌重復(fù)利用4次后,其對(duì)100 mg/L毒死蜱的降解率仍達(dá)47%。因此,固定化菌在毒死蜱污染的凈化去毒方面有著重大的現(xiàn)實(shí)意義。
【圖文】：

氣池中得到富集，使活性污泥的濃度增加，增加了污染物與活性污泥的接觸時(shí)間，從而可以提高污染物的去除率（Low等，2005；Al-Malack，2006）。膜生物反應(yīng)器可以分為一體式生物反應(yīng)器和分體式生物反應(yīng)器（劉強(qiáng)等，2009）。圖66和圖67分別表示的是一體式和分體式膜生物反應(yīng)器的流程圖。楚小強(qiáng)等（2008）采用一體式膜生物反應(yīng)器工藝，以酰胺類除草劑生產(chǎn)廢水為處理對(duì)象，研究了環(huán)境條件和進(jìn)水化學(xué)需氧量（CODcr）對(duì)處理效果的影響，結(jié)果表明膜生物反應(yīng)器對(duì)農(nóng)藥廢水中的CODcr、農(nóng)藥、濁度和臭等均有很好的去除效果。當(dāng)前膜生物反應(yīng)器在我國推廣尚存在一些問題，包括膜材料的價(jià)格問題、膜污染問題、膜組件的性能問題以及系統(tǒng)操作參數(shù)和條件的復(fù)雜性等，欲使其應(yīng)用于實(shí)際工程，還需做大量的工作（Psoch等，2006）。針對(duì)一些中小型農(nóng)藥企業(yè)

氣池中得到富集，使活性污泥的濃度增加，增加了污染物與活性污泥的接觸時(shí)間，從而可以提高污染物的去除率（Low等，2005；Al-Malack，2006）。膜生物反應(yīng)器可以分為一體式生物反應(yīng)器和分體式生物反應(yīng)器（劉強(qiáng)等，2009）。圖66和圖67分別表示的是一體式和分體式膜生物反應(yīng)器的流程圖。楚小強(qiáng)等（2008）采用一體式膜生物反應(yīng)器工藝，以酰胺類除草劑生產(chǎn)廢水為處理對(duì)象，研究了環(huán)境條件和進(jìn)水化學(xué)需氧量（CODcr）對(duì)處理效果的影響，結(jié)果表明膜生物反應(yīng)器對(duì)農(nóng)藥廢水中的CODcr、農(nóng)藥、濁度和臭等均有很好的去除效果。當(dāng)前膜生物反應(yīng)器在我國推廣尚存在一些問題，，包括膜材料的價(jià)格問題、膜污染問題、膜組件的性能問題以及系統(tǒng)操作參數(shù)和條件的復(fù)雜性等，欲使其應(yīng)用于實(shí)際工程，還需做大量的工作（Psoch等，2006）。針對(duì)一些中小型農(nóng)藥企業(yè)
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：X172;X592

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 莫彩萍;白腐菌及錳過氧化物酶（MnP）對(duì)農(nóng)藥毒死蜱的降解研究[D];南京林業(yè)大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2601181