發(fā)布時間：2016-11-25 23:30

  本文關鍵詞：Shox2介導HCN4基因修飾犬MSCs定向分化心臟起搏樣細胞的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《第三軍醫(yī)大學》 2015年

Shox2介導HCN4基因修飾犬MSCs定向分化心臟起搏樣細胞的實驗研究

馮媛媛  

【摘要】：背景和目的近年來,隨著分子生物學、細胞生物學、基因工程學及細胞移植技術的快速發(fā)展,心臟“生物起搏”(biologicɑl pɑcemɑker)研究已成為探索治療緩慢性心律失常新方法的又一熱點。而縱觀心臟生物起搏研究歷程,主要經(jīng)歷了“細胞治療、基因轉移及基因細胞治療”三個階段,而“基因細胞治療”是將起搏基因轉染干細胞后再注入心臟,共同增強心臟生物起搏功能。起搏電流(current funny,If)是竇房結細胞舒張期自動除極化的主要決定因素。超極化激活的環(huán)化核苷酸門控通道(HCN)基因家族是If形成的分子基礎,HCN基因家族有四個成員:HCN1~HCN4,其中HCN4在動物竇房結細胞的比例最高,是If產(chǎn)生及維持基本竇性心律的重要因素。近年來,本課題組對HCN4基因轉染骨髓間充質干細胞(Mesenchymɑl stem cells,MSCs)體外誘導分化及重建心臟生物起搏點進行了系列研究,不僅在體外成功誘導出可穩(wěn)定表達HCN4、且具有自主搏動特性的心臟起搏樣細胞;而將HCN4基因修飾的MSCs移植至Ⅲo房室傳導阻滯犬心室肌,4周后可記錄到起源于移植部位的室性自主節(jié)律,但因其頻率較慢(59±5次/分),不能滿足實驗動物生理需要。因而導入新的功能基因,使HCN4基因修飾的MSCs移植后繼續(xù)保持起搏細胞基因表型及起搏功能,已成為心臟生物起搏研究的新策略。既往研究顯示,竇房結發(fā)育是一嚴格的基因調控過程,許多基因參與了該調控網(wǎng)絡,包括HCN4、Tbx3、Nkx2.5和Shox2。同源結構域轉錄因子(homeodomɑin trɑnscription fɑctor)Shox2是近年發(fā)現(xiàn)的重要的轉錄調控因子,只在竇房結區(qū)域特異性表達。Shox2的無效突變可導致胚胎死亡,Tbx3和HCN4表達下降。在爪蟾和小鼠胚胎中過表達Shox2能下調Nkx2.5的表達,說明Shox2通過抑制Nkx2.5,在竇房結分化過程中具有重要的作用。但Shox2對HCN4的調控及維持起搏細胞基因表型的作用及機理尚不十分清楚。我們推測Shox2通過抑制Nkx2.5而上調Tbx3與HCN4表達,進而促進HCN4基因修飾的MSCs移植后繼續(xù)保持起搏細胞基因表型及起搏功能,達到提高新建生物起搏點起搏頻率之目的。為驗證上述理論假設,本研究擬采用雙基因轉染技術,將Shox2與HCN4雙基因共同轉染至犬MSCs,并行脈沖微電流刺激(electric pulse current stimulɑtion,EPCS)模擬體內(nèi)微電環(huán)境,在體外進行誘導分化培養(yǎng),以獲得具有心臟起搏細胞特性的起搏樣細胞,為在體心臟生物起搏研究奠定實驗基礎。研究方法1.參照本實驗室前期建立的方法進行犬MSCs分離、培養(yǎng)與鑒定,而后進行MSCs純化及擴增,倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)學特征。2.慢病毒載體構建:分別構建攜帶HCN4+GFP、Shox2+RFP基因及僅含RFP的慢病毒載體,獲得p Lentis-HCN4-GFP、p Lentis-Shox2-RFP及p Lentis-RFP。病毒載體內(nèi)攜帶嘌呤霉素抗藥基因可用于細胞純化。3.將已構建好的慢病毒載體分別轉染至第3代生長良好的c MSCs,獲得以下四組。①HCN4組:轉染p Lentis-HCN4-GFP。②Shox2組:轉染p Lentis-Shox2-RFP。③Shox2-HCN4組:共轉染p Lentis-Shox2-RFP和p Lentis-HCN4-GFP。④對照組(RFP組):只轉染p Lentis-RFP。轉染前行預實驗確定慢病毒的最佳細胞轉染密度、最佳轉染體系、共轉染的最佳轉染體系,必要時可用嘌呤霉素篩選純化轉染陽性的細胞。各組細胞分別進行體外擴增培養(yǎng)。4.對經(jīng)誘導分化培養(yǎng)后的各組細胞進行檢測①細胞形態(tài)學檢測:光學顯微鏡下觀察各組細胞大小及形態(tài)結構特征;透射電鏡觀察細胞超微結構及細胞間連接特征。②免疫熒光檢測各組細胞Shox2、HCN4、Cx43、Cx45、c Tn T蛋白表達。③分別用定量RT-PCR(q RT-PCR)、Western blotting方法檢測相關基因m RNA和蛋白表達情況,如:Shox2、Nkx2.5、Tbx3、HCN4、Cx43、Cx45等。④細胞電生理學檢測:選擇培養(yǎng)至5-7天的細胞,用全細胞膜片鉗技術檢測各組細胞膜電流If表達情況。5.EPCS誘導經(jīng)Shox2、HCN4基因修飾的c MSCs分化為心臟起搏樣細胞(1)實驗分組①基因轉染組:又分為HCN4組、Shox2組、Shox2-HCN4組、RFP組(對照組)。②基因轉染+EPCS誘導組:又分為HCN4+EPCS組、Shox2+EPCS組、Shox2-HCN4+EPCS組、RFP+EPCS組。(2)體外誘導培養(yǎng)與檢測①將基因轉染+EPCS誘導組細胞傳代到60 mm的培養(yǎng)皿中,鉑金絲為電極導絲。②在細胞種植后第二天即開始行EPCS,每天刺激3-6 h,刺激5天直到細胞達到95%增殖,中途換液1次。所有實驗均重復3次。③取EPCS刺激第5天的轉染+EPCS誘導組細胞,轉染組細胞為同一代數(shù)培養(yǎng)第5天的細胞進行檢測,檢測方法與內(nèi)容同方法4。結果1.犬MSCs的分離、培養(yǎng)采用全細胞貼壁篩選分離法培養(yǎng)c MSCs,原代細胞48 h首次換液后,貼壁細胞呈類圓形、多角形、短梭形,細胞生長緩慢。5~7天后貼壁細胞分裂增殖加快,相鄰細胞之間逐漸匯合,可見集落形成,10~14天細胞生長融合可達80%,呈渦旋狀或放射狀分布排列。傳代培養(yǎng)后c MSCs貼壁速度比原代細胞快,呈均勻分布生長。隨著細胞換液和傳代,貼壁細胞形態(tài)逐漸趨于一致;傳代至第3代時可得到純化的呈典型多邊形或長梭形的細胞,胞體飽滿,折光性好,具有良好的增殖能力。2.慢病毒載體介導Shox2、HCN4雙基因轉染犬MSCs(1)轉染效率的比較①單獨轉染p Lentis-Shox2-RFP、p Lentis-HCN4-GFP:以1.0×104 cells/cm2的密度傳代,在次日轉染時細胞達到50~60%匯合;慢病毒轉染復數(shù)MOI=20,聯(lián)合助轉染劑polybrene 2ug/ml,轉染時間24 h,該條件下行轉染可取得良好的效果。細胞轉染后72~96 h,HCN4組細胞可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白GFP的表達;Shox2組細胞可觀察到紅色熒光蛋白RFP的表達,兩組細胞隨著培養(yǎng)時間增加,熒光蛋白表達呈增多、增強的趨勢。在MOI=20時,HCN4組和Shox2組細胞的轉染效率分別為92±3.7%和94±2.5%(n=5),與對照組RFP組細胞的轉染效率相當(96±3.5%)。說明此兩實驗組細胞的轉染效率良好。②共轉染p Lentis-Shox2-RFP和p Lentis-HCN4-GFP:以1.0×104 cells/cm2的密度傳代,在次日轉染時細胞達到50~60%,給予先轉染Shox2(MOI=20,polybrene 2ug/ml);24h后棄去廢液,重新加入慢病毒HCN4(MOI=27,polybrene 2ug/ml)。結果發(fā)現(xiàn):聯(lián)合HCN4共轉染72 h后,Shox2-HCN4組細胞可在熒光顯微鏡下觀察到紅綠兩種熒光蛋白混合表達(偏紅色、偏綠色、混合橙色),激光共聚焦顯微鏡下計數(shù)Shox2-HCN4共轉染細胞的比例為85±2.3%(n=5),共轉染效率較高。(2)細胞形態(tài)學變化轉染慢病毒后,HCN4組、Shox2組和Shox2-HCN4組細胞較對照組細胞生長變慢,其中Shox2-HCN4組細胞生長更慢。三組細胞形狀也發(fā)生了巨大的變化,顯微鏡下可見少數(shù)細胞呈分叉和長棒形。(3)免疫熒光結果分析免疫熒光結果顯示,HCN4組細胞可見HCN4蛋白表達;Shox2組和Shox2-HCN4組細胞除能表達Shox2蛋白外,還可見HCN4及心肌特異性標志物c Tn T表達,其中以Shox2-HCN4組表達更顯著。(4)分子生物學檢測選擇培養(yǎng)5-7天的各組細胞,PCR和Western blotting結果顯示:①HCN4、Tbx3和Cx45:與僅轉染RFP的對照組比較,Shox2組中HCN4、Tbx3和Cx45的m RNA和蛋白表達均增加;Shox2-HCN4組Tbx3和Cx45增加較Shox2組更顯著;HCN4組中可見Cx45的表達。②Nkx2.5及Cx43:與僅轉染RFP的對照組比較,Shox2組Nkx2.5、Cx43的m RNA和蛋白表達均下降;Shox2-HCN4組Nkx2.5、Cx43 m RNA和蛋白表達下降更為顯著;HCN4組細胞中可見Cx43的表達。(5)全細胞膜片鉗檢測①Shox2組:32%(6/19)的細胞可記錄到超極化激活的內(nèi)向電流,該電流具有明顯的時間及電壓依賴特性,且對細胞外Cs+敏感,證實其為If電流。根據(jù)記錄到的尾電流重建該內(nèi)向電流曲線和翻轉電位,并進行Boltzmɑnn擬合和計算,結果顯示:Shox2組細胞在-160 m V的電流幅值為-1062.3±18.6 p A,電流密度為-44.3±5.4 p A/p F,半數(shù)最大激活電壓為-94.3±6.3 m V,斜率為-16.8±1.6,翻轉電位是-27.4±3.8 m V。②HCN4組:76%(16/21)的細胞可記錄到If電流,其-160m V的電流幅值為-1081.5±15.4 p A,電流密度為-45.6±7.7 p A/p F,半數(shù)最大激活電壓為-101.2±4.6 m V,斜率為-16.0±1.6,翻轉電位是-26.4±3.8 m V。③Shox2-HCN4組:80%(12/15)的細胞能記錄到If電流,其-160 m V的電流幅值為-2015.1±17.1 p A,電流密度為-67.6±6.7 p A/p F,半數(shù)最大激活電壓為-100.3±4.0m V,斜率為-22.2±2.1,翻轉電位是-27.5±3.1 m V。3.經(jīng)EPCS誘導后各組細胞形態(tài)及功能變化(1)細胞形態(tài)學變化HCN4組、Shox2組和Shox2-HCN4組細胞給予EPCS誘導后,細胞體積變大,呈紡錘樣和蜘蛛樣改變。細胞增殖最終變緩慢。免疫熒光結果顯示:EPCS誘導后,Shox2組和Shox2-HCN4組細胞HCN4和c Tn T的表達更加顯著。(2)分子生物學檢測取EPCS刺激第5天的轉染+EPCS誘導組細胞,單純轉染組細胞為同一代數(shù)培養(yǎng)第5天的細胞進行檢測。PCR和Western blotting結果顯示:①HCN4、Tbx3和Cx45:經(jīng)EPCS誘導后,Shox2組HCN4、Tbx3和Cx45的m RNA和蛋白表達增加較誘導前更顯著(p0.05);Shox2-HCN4組中Tbx3和Cx45增加較誘導前更顯著(p0.05);HCN4組Cx45表達較誘導前明顯增加(p0.05)。②Nkx2.5及Cx43:經(jīng)EPCS誘導后,Shox2組Nkx2.5、Cx43的m RNA和蛋白表達均較誘導前明顯下降(p0.05);Shox2-HCN4組Nkx2.5及Cx43表達量下降較誘導前更加顯著(p0.05);HCN4組Cx43表達較誘導前明顯增加(p0.05)。(3)全細胞膜片鉗檢測①Shox2+EPCS組:73%(16/22)的細胞可記錄到If電流,-160m V的電流幅值為-1350.1±16.5 p A(p0.05),電流密度為-51.9±8.3 p A/p F(p0.05),半數(shù)最大激活電壓為-91.2±5.1 m V(p0.05),斜率為-17.5±1.8,翻轉電位是-29.5±4.2 m V。②HCN4+EPCS組:77%(17/22)的細胞可記錄到If電流,-160m V的電流幅值為-1343.4±18.6 p A(p0.05),電流密度為-53.7±4.0 p A/p F(p0.05),半數(shù)最大激活電壓為-92.4±4.8 m V(p0.05),斜率為-18.8±1.8(p0.05),翻轉電位是-28.9±3.0 m V(p0.05)。③Shox2-HCN4+EPCS組:73%(11/15)的細胞能記錄到If電流,-160m V的電流幅值為-2380.5±64.8 p A(p0.05),電流密度為-78.5±11.5 p A/p F(p0.05),半數(shù)最大激活電壓為-94.1±4.0 m V(p0.05),斜率為-21.4±1.9,翻轉電位是-31.3±3.9 m V。結論1.應用慢病毒載體p Lentis-Shox2-RFP和p Lentis-HCN4-GFP成功將Shox2-HCN4雙基因共同轉染入c MSCs。2.c MSCs轉染Shox2后,能夠促進c MSCs向心臟起搏樣細胞分化。可觀察到心肌特異性標志物c Tn T,在基因和蛋白水平表達起搏細胞標志物HCN4,Tbx3和Cx45,而抑制心肌工作細胞標志物Nkx2.5及Cx43的表達,并能產(chǎn)生功能性If起搏電流,具有心臟發(fā)育早期的起搏樣細胞特點。3.EPCS作為誘導干預手段能夠促進轉染Shox2的c MSCs向起搏樣細胞分化,使If表達增多,電流特征良性改變,具有心臟起搏樣細胞的電生理特點。4.Shox2-HCN4雙基因共轉染+EPCS誘導,有促進c MSCs向起搏樣細胞方向分化的疊加效應。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R541.7
【目錄】：

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7 沈留成;;陽萎患者陰莖海綿體平滑肌細胞超微結構的研究[A];新編男科理論與臨床——中華中醫(yī)藥學會第七屆中醫(yī)男科學術大會;全國中醫(yī)男科臨床與科研方法高級研修班;2006年云南省中醫(yī)男科診療技術培訓班講義與論文集[C];2006年

8 譚峰;萬賽英;吳�？�;霍綺雯;王金良;陳文霖;方美鳳;劉曉林;孫景波;成家茂;;電針對高血壓大鼠腦缺血neurocan-mRNA表達與細胞超微結構的影響[A];國家中醫(yī)藥管理局腦病重點研究室建設研討會暨中風病科研成果推廣交流會論文匯編[C];2010年

9 丁素菊;黎佳思;;通心絡對缺血大鼠腦細胞超微結構及線粒體呼吸功能的保護作用[A];第九次全國神經(jīng)病學學術大會論文匯編[C];2006年

10 靳翠紅;巫生文;劉秋芳;馬健飛;蔡原;;放線菌素D處理V79細胞后CM誘導旁觀者效應的實驗研究[A];中國毒理學會放射毒理專業(yè)委員會第七次、中國毒理學會免疫毒理專業(yè)委員會第五次、中國環(huán)境誘變劑學會致突專業(yè)委員會第二次、中國環(huán)境誘變劑學會致畸專業(yè)委員會第二次、中國環(huán)境誘變劑學會致癌專業(yè)委員會第二次全國學術會議論文匯編[C];2008年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 馮媛媛;Shox2介導HCN4基因修飾犬MSCs定向分化心臟起搏樣細胞的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

2 姚陳果;可控陡脈沖對惡性腫瘤細胞不可逆性電擊穿的實驗和機理研究[D];重慶大學;2003年

3 石英愛;RNA干涉HeLa細胞端粒酶對其細胞生物學行為的影響及其作用機制的研究[D];吉林大學;2007年

4 江閏德;A549細胞超微結構體視學研究[D];南方醫(yī)科大學;2010年

5 張琰君;左旋苯甲酰脯氨醇自由基的細胞毒性及其分子機制研究[D];第四軍醫(yī)大學;2011年

6 李黎;消癌解毒方對H22荷瘤小鼠和人肝癌SMMC-7721細胞的影響及機制研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2013年

7 郭輝;姜黃素對雄激素依賴性及雄激素非依賴性前列腺癌細胞的誘導凋亡作用[D];華中科技大學;2006年

8 丁沖;穩(wěn)恒磁場對細胞電磁特性和生物學效應的影響[D];西北工業(yè)大學;2014年

9 葉韻斌;Grb2抑制劑peptidimer-c抗K_（562）細胞的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學;2007年

10 周南;碳點的細胞行為學研究與神經(jīng)示蹤應用[D];吉林大學;2015年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫海燕;升麻中環(huán)菠蘿蜜烷型三萜化合物抗腫瘤活性及作用機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

2 陳麗娜;芪蛭皺肺顆粒對LPS致炎AT-Ⅱ細胞p38MAPK信號通路的影響[D];甘肅中醫(yī)藥大學(原名：甘肅中醫(yī)學院);2015年

3 李夢姣;藍萼甲素對人肺癌A549細胞的抑制作用及其機制[D];蘇州大學;2013年

4 王勇;二甲基亞砜對貧鈾誘發(fā)人支氣管上皮細胞損傷的保護機制研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2006年

5 孫大林;養(yǎng)精膠囊提取液對Leydig細胞睪酮合成的影響及機制研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2012年

6 徐玲玲;穩(wěn)恒磁場與抗腫瘤藥物聯(lián)合作用對腫瘤細胞殺傷效應的研究[D];陜西師范大學;2008年

7 劉曉暉;溫度和銅對鯉魚肝臟細胞超微結構的影響[D];東北師范大學;2006年

8 鄭末;工頻均勻強磁場對體外培養(yǎng)SNU細胞影響的研究[D];河北醫(yī)科大學;2004年

9 丁雅明;中晚期小鼠胚胎與惡性腫瘤細胞H_（22）相互作用的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2008年

10 何海濱;番荔枝內(nèi)酯單體Desacetyluvaricin對乙肝相關肝癌細胞TLR4、P53蛋白表達的影響[D];暨南大學;2008年

  本文關鍵詞：Shox2介導HCN4基因修飾犬MSCs定向分化心臟起搏樣細胞的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：193115