研究背景及意義結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma, CRC)是一種人類常見的惡性腫瘤,是在內(nèi)、外因素影響下發(fā)生的多基因表達失調(diào)的一種個體化疾病,嚴(yán)重威脅著人類生命健康。從分子水平解釋結(jié)直腸癌,有助于闡釋這種高發(fā)腫瘤發(fā)生發(fā)展機制,為其早期診斷提供基因檢測工具,為從分子水平的定向治療提供前瞻標(biāo)志物,其中一些高頻突變和一些常見信號通路有可能成為治療結(jié)直腸癌的靶點。蛋白質(zhì)的泛素化修飾是人體內(nèi)非常重要的一種翻譯后的修飾方式,該修飾可以與被修飾蛋白的穩(wěn)定性和功能活性狀態(tài)有關(guān)。它可以有效調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和免疫炎癥反應(yīng)等病理生理過程。其中E3連接酶是泛素蛋白酶中種類最多的一種,目前認(rèn)為泛素系統(tǒng)不僅僅是細(xì)胞中蛋白質(zhì)的重要降解系統(tǒng),它能通過調(diào)控底物蛋白質(zhì)的活性,參與調(diào)節(jié)多種重要的生命過程的發(fā)生和發(fā)展,泛素系統(tǒng)的異常與機體的炎癥性疾病、腫瘤等有很大的關(guān)系。神經(jīng)調(diào)節(jié)素受體降解蛋白1(NrdP1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種泛素E3連接酶,它不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和免疫炎癥反應(yīng)等病理生理過程,而且有研究顯示NrdP1能抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。目前,在大腸癌中Nrdp1已經(jīng)被證明能夠通過下調(diào)p27表達來抑制腫瘤細(xì)胞的生長。然而,Nrdp1是否能夠調(diào)節(jié)大腸癌細(xì)胞的侵襲能力至今尚未明確。本研究致力于Nrdp1在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲中的作用及機理研究。體外研究中我們通過RT-PCR、Western blotting的方法研究了結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞中Nrdp1和MMP7之間的關(guān)系,進一步通過siRNA敲除Nrdp1、MMP7在Caco-2細(xì)胞中的表達研究了Nrdp1在腫瘤侵襲中的作用并探討具體作用機制。Western blotting方法檢測結(jié)腸癌組織中Nrdp1及相關(guān)分子的表達并分析研究。最終,我們首次闡明了Nrdp1可能通過抑制EGFR下游信號通路中的ERK/MAPK通路來抑制MMP7在大腸癌細(xì)胞中的表達和在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲中的作用。本研究為更好的理解Nrdp1在腫瘤中的作用提供了新的理論依據(jù)。目的對大腸癌患者結(jié)腸癌組織(CR)和癌旁組織(NT)中Nrdp1及MMP7的表達情況進行檢測,并對其相關(guān)性進行分析；探討Nrdp1對MMP7的影響及其對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的作用。方法收集20例組織標(biāo)本(結(jié)直腸癌組織和配對的癌旁正常組織),所有的組織標(biāo)本均來源于是山東大學(xué)附屬濟南市中心醫(yī)院2008年～2014年間病理及臨床診斷為結(jié)直腸癌的患者。Western Blotting方法檢測20例大腸癌患者結(jié)腸癌組織(CR)和癌旁組織(NT)中Nrdp1及MMP7的表達情況；結(jié)直腸癌組織Nrdp1與MMP7表達進行相關(guān)性分析；在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系Caco-2的基礎(chǔ)上,通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法構(gòu)建了過度表達Nrdp1 (Caco-2-nrdp1)的細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Caco-2細(xì)胞(Caco-2null)作為對照,同時采用Nrdp1siRNA轉(zhuǎn)染caco-2細(xì)胞作為抑制Nrdp1表達(Caco-2-shndpl)的細(xì)胞系,分析不同Nrdp1表達水平人結(jié)直腸癌細(xì)胞系caco-2中MMP7的表達情況,同時采用Western Blotting方法進一步驗證不同Nrdp1表達水平人結(jié)直腸癌細(xì)胞系caco-2中MMP7的表達情況；為了繼續(xù)研究Nrdp1是否影響MMP7在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲中的作用,我們首先將MMP7siRNA和Ncontrol siRNA轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞并分別命名為MMP7si-Caco-2和NCsi-Caco-2細(xì)胞,檢測轉(zhuǎn)染48 h后用Real Time PCR及Western blotting分別檢測MMP7mRNA水平、蛋白水平的敲低效果；比較聯(lián)合敲低Nrdp1/MMP7與單獨敲低MMP7之后的MMP7表達水平；比較聯(lián)合敲低Nrdp1/MMP7與單獨敲低MMP7之后的細(xì)胞侵襲能力；比較不同Nrdp1表達水平人結(jié)直腸癌細(xì)胞系caco-2侵襲能力；對Nrdp1抑制MMP7在大腸癌細(xì)胞中的表達和在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲中的作用的信號通路進行篩選；比較聯(lián)合敲低Nrdp1/MMP7與單獨敲低MMP7之后的細(xì)胞增殖能力；比較聯(lián)合敲低Nrdp1/MMP7與單獨敲低MMP7之后的細(xì)胞凋亡比例。結(jié)果結(jié)直腸癌中Nrdp1的表達水平顯著低于癌旁組織(P0.05), MMP7的表達水平顯著高于癌旁組織(P0.05)；Nrdp1及MMP7的表達呈負(fù)相關(guān)相關(guān)(r=-0.82,P0.001)。Caco-2-nrdp1細(xì)胞中Nrdp1表達升高,Caco-2-shnrdp1細(xì)胞中Nrdp1表達顯著下降(P0.05)。同時我們的研究發(fā)現(xiàn),在Caco-2-nrdpl細(xì)胞中MMP7的表達水平顯著下降,而caco-2-shnrdp1細(xì)胞中MMP7的水平顯著升高(P0.05),同時Western Blotting也驗證了這個結(jié)果。MMP7siRNA轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞后,MMP7的表達被有效下調(diào)了。Caco-2細(xì)胞中敲低Nrdpl之后MMP7水平明顯升高,聯(lián)合敲低Nrdp1/ MMP7之后MMP7水平較單獨敲低MMP7明顯升高(P0.05)。Ncontrol siRNA和MMP7 siRNA作用Caco-2細(xì)胞后穿膜的平均細(xì)胞數(shù)分別為252.67±14.16個和56.00±5.00個,Nrdp1/MMP7 siRNA聯(lián)合作用Caco-2細(xì)胞后穿膜的平均細(xì)胞數(shù)為156.00±10.00個,提示Caco-2細(xì)胞中敲低MMP7后細(xì)胞侵襲能力明顯下降,聯(lián)合敲低Nrdp1/MMP7后細(xì)胞侵襲能力較單獨敲低MMP7明顯上升,表明Nrdpl抑制了MMP7在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲中的作用。Caco-2-Nrdp1、Caco-2null、Caco-2-shNrdp1作用Caco-2細(xì)胞后穿膜的平均細(xì)胞數(shù)分別為89.60±12.10個、152.00±8.00個和589.00±12.00個；在Caco-2-shNrdp1細(xì)胞中抑制MMP7的表達, Caco-2-shNrdp1-shMMP7作用Caco-2細(xì)胞后穿膜的平均細(xì)胞數(shù)為126.40±4.35個,表明Caco-2-Nrdp1細(xì)胞的侵襲能力最弱,caco-2-shNrdp1細(xì)胞的侵襲能力最強；在Caco-2-shNrdp1細(xì)胞中抑制MMP7的表達,caco-2-shNrdp1的侵襲能力降低。PD98059沒有影響Nrdp1的表達水平,但抑制了MMP7的表達水平(P0.05),導(dǎo)致了細(xì)胞侵襲力的顯著下降(P0.05),提示Nrdp1可能通過抑制ERK / MAPK通路抑制MMP7的表達。Caco-2細(xì)胞中敲低MMP7后細(xì)胞增殖能力明顯下降,聯(lián)合敲低Nrdp1/MMP7之后細(xì)胞增殖能力較單獨敲低MMP7明顯降低。Ncsi-Caco-2細(xì)胞、MMP7si-Caco-2細(xì)胞和Nrdp1/MMP7si-Caco-2調(diào)亡比例分別為0.8%、1.6%和1.9%,由于對照組細(xì)胞的調(diào)亡比例很低,我們分析Caco-2細(xì)胞處在增殖期,不在調(diào)亡期,因此敲低MMP7與聯(lián)合敲低Nrdp1/MMP7可能不影響細(xì)胞的調(diào)亡。結(jié)論1.在結(jié)直腸癌組織中Nrdp1的表達下降,MMP7的表達升高,兩者呈負(fù)相關(guān)；2.結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2中聯(lián)合敲除Nrdp1/MMP7之后細(xì)胞侵襲能力較單獨敲低MMP7明顯升高；繁殖能力降低；而對細(xì)胞凋亡的影響不大；Caco-2-nrdp1細(xì)胞的侵襲能力最弱,Caco-2-shnrdp1細(xì)胞的侵襲能力最強,同時在Caco-2-shnrdp1細(xì)胞中抑制MMP7的表達,Caco-2-shnrdp1的侵襲能力降低,說明Nrdp1抑制MMP7在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲中的作用；3. Nrdp1可能通過抑制EGFR下游信號通路中的ERK/MAPK通路來抑制MMP7在大腸癌細(xì)胞中的表達。綜上所述,本研究證實了Nrdp1/MMP7新通路可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力,表明Nrdp1在腫瘤細(xì)胞中有多種功能,因此本研究豐富了Nrdp1通過泛素化某些蛋白調(diào)控某些細(xì)胞功能,為腫瘤分子生物學(xué)研究提供了新的方向。

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34
【目錄】：

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳世敏;王啟棟;胡成進;;泛素蛋白酶體系統(tǒng)與大腸癌[J];武警醫(yī)學(xué);2014年03期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 史小雨;結(jié)直腸癌變相關(guān)基因表達譜的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

2 張圓;泛素E3連接酶Nrdp1在缺血再灌注心肌損傷中的作用及分子病理機制[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 于倩;結(jié)直腸癌中MAP4K4基因功能的初步研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

【共引文獻】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳皇;膀胱癌CYR61基因異常表達的臨床生物學(xué)意義及其分子機制[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

【二級參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 梁璇;丁新民;霍艷英;潘興斌;隋建麗;白貝;徐勤枝;周平坤;;ERK1/2-Sp1信號通路對肺癌細(xì)胞VEGF的調(diào)控作用[J];癌變.畸變.突變;2007年04期

2 Ioannis A Voutsadakis;;Peroxisome proliferator activated receptor-γ and the ubiquitin-proteasome system in colorectal cancer[J];World Journal of Gastrointestinal Oncology;2010年05期

3 鄭樹,蔡善榮;中國人大腸癌的流行病學(xué)研究(英文)[J];The Chinese-German Journal of Clinical Oncology;2003年02期

4 楊玲,李連弟,陳育德,D.M.Parkin;中國2000年及2005年惡性腫瘤發(fā)病死亡的估計與預(yù)測[J];中國衛(wèi)生統(tǒng)計;2005年04期

5 ;Changing patterns of colorectal cancer in China over a period of 20 years[J];World Journal of Gastroenterology;2005年30期

6 胡蓉環(huán);劉安文;蔡婧;張樹輝;;MAP4K4在肝細(xì)胞癌中的表達及意義[J];腫瘤防治研究;2011年07期